血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性V279F与缺血性卒中易感性及复发的相关性研究

马永盛，潘旭东

人类血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）乙酰水解酶（acetylhydrolase，AH）是一种非钙离子依赖性水解酶，主要由巨噬细胞和成熟的淋巴细胞所分泌，在低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholestreol，LDL-C）表面水解氧化型磷脂，产生氧化型脂肪酸和溶血卵磷脂，因后两者可导致炎症相关黏附分子和细胞因子的表达，下调一氧化氮表达，升高氧化应激并导致血管内皮细胞凋亡，从而具有促动脉粥样硬化作用[1-2]。

人类PAF-AH被PLA2G7基因编码，该基因位于6号染色体6p21-p12，目前发现PAF-AH基因与心脑血管病发病相关，其中位于9号外显子的V279F基因多态性位点（rs16874954），已经发现与日本人冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性卒中及颈动脉粥样硬化等疾病相关[3]。但是在韩国展开的类似研究却得出了相反的结论[4]。到目前为止V279F基因多态性位点与中国汉族人群缺血性脑血管病的发病及预后研究较少。本研究对PLA2G7基因多态性V279F与低分子肝素试验病因分型（the Trial of Org10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）亚型及缺血卒中复发的关系做一探讨，以明确PAF-AH基因多态性与缺血性卒中发病及复发的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究观察缺血性卒中患者及对照组相关危险因素及基因型分布为回顾性病例对照研究，随访分析卒中患者复发的影响因素为前瞻性研究，连续选取2008年11月～2014年11月山东省潍坊市人民医院神经内科住院的首发急性TOAST分型[5]中大动脉粥样硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）性卒中和小动脉闭塞（small-artery occlusion，SAO）性卒中患者共386例为试验组。对照组为我院同期既往无卒中及其他神经系统疾病证据的健康体检者386例。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象均签订知情同意书。

1.2 入组标准 年龄36～90岁；发病＜72 h，诊断符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准[6]；为首次发病；全部患者均经颅脑计算机断层扫描（computed tomography，CT）和（或）磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）检查证实；符合TOAST分型[5]中的LAA性卒中和SAO性卒中。

1.3 排除标准 短暂性脑缺血发作，中枢神经系统肿瘤，脑血管畸形，自身免疫病，严重心脏疾病及近期发生心肌梗死、心绞痛、近期输血、服用抗凝、抗血小板药物者，TOAST分型[5]中的心源性卒中、不明原因性卒中、其他原因所致卒中。

1.4 方法

1.4.1 危险因素评估 记录所有研究对象的临床资料，包括身高、体重、既往史、家族史、血压、血糖、血脂等，并计算体重指数（body mass index，BMI），BMI=体重（kg）/身高（m）2[7]。所有研究对象均完成颅脑MRI或CT检查明确颅内病变，并行颈部血管超声，经颅多普勒、颅脑磁共振血管成像/计算机断层扫描血管成像/数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）检查明确脑血管情况，完成心脏超声和心电图检查明确心脏病变情况。

危险因素评估标准：冠状动脉粥样硬化性心脏病：运动或其他增加心肌需氧量时出现胸痛发作，休息或含服硝酸甘油后疼痛迅速消失，症状持续1个月以上[8]；吸烟：确诊时患者吸烟平均≥每天10支，并超过5年或已戒烟但未超过5年[9]；饮酒：每日酒精摄入量≥24 g/d[10]；糖尿病：空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或任意时刻血糖≥11.1 mmol/L，并有典型糖尿病症状[11]；高血压：收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg[12]；高脂血症：血清总胆固醇水平超过5.72 mmol/L，血清甘油三酯水平超过1.7 mmol/L，或目前应用降脂药物治疗[13]。

1.4.2 血液的采集 所有研究对象均于清晨空腹抽取前臂静脉血（病例组于入院后次日凌晨采血）6 ml。3 ml血置于普通生化试管，室温固定2 h，离心（3000 r/min）10 min，收集上清液于Eppendof管中，－80℃冻存待测。3 ml置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管，室温固定2 h，常温下2700 r/min离心10 min，收集白细胞层置于Eppendof管中，－80℃保存待测，留取作提取脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）用，集中做多态性分析。

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

1.4.3 PAF-AH浓度测定 采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血浆PAF-AH浓度，试剂盒应用美国R&D公司PAF-AH定量测定试剂盒，操作步骤严格按说明书进行。

1.4.4 外周全血基因组DNA提取 应用血液基因组DNA提取试剂盒（非离心柱型）提取白细胞DNA（上海生工生物工程有限公司），操作步骤严格按说明书进行。

1.4.5 PAF-AH基因多态性V279F分析

1.4.5.1 PCR扩增 应用聚合酶链式反应法进行基因扩增，分光光度法对DNA扩增产物进行纯度测定，DNA样本保存于－20℃冰箱。PCR所用引物均由上海生物技术工程有限公司设计并核查，V279F引物序列：上游引物为5′TCTTATTTTCTTACCTGAATCTCTGA 3′，下游引物为5′CATCCCCATGAAATGAA CAAT3′。使用美国ABI公司生产PCR反应仪扩增目的基因片段。PCR总反应体系50 μl：DNA模板1 μl（10～50 μg/L），预混DNA聚合酶（PremixExTaq）0.5 μl，上下游引物各1 μl（10 μmol/L），三磷酸脱氧核（糖核）苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μl，氯化镁（MgCl2）5 μl，加双蒸水至50 μl。P CR条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火35 s，72℃延伸40 s，72℃修复延伸5～8 min，共35个循环。PCR反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳150 V、100 mA 20 min电泳观察，PCR扩增产物大小约221 bp（图1）。

1.4.5.2 PAF-AH基因V279F多态性分析 由上海生物工程技术有限公司采用基因直接测序法确定V279F多态性位点的单核苷酸多态性，PAF-AH基因V279F位点存在VV、VF、FF 3种基因型（图2）：VV为野生型，VF为突变杂合子，FF为突变纯合子。

图2 PAF-AH基因V279F多态性位点单向测序图

1.4.6 随访 为评价基因多态性与缺血性卒中复发的相关性，本研究仅对试验组患者随访4.5年（范围0.1～6年）。终点事件为复发急性缺血性卒中，为首次卒中后，原有症状痊愈或有好转后再次出现新的中枢神经系统损害的定位体征或原有症状加重，头部CT或MRI证实有新的一致性病灶或原有病灶扩大，诊断标准符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准[5]。随访由内科学研究人员通过标准提问和电话随访，对出现卒中复发症状者进一步行颅脑影像学检查确诊复发。其中23例患者因为移民失访。最终363例缺血性卒中患者完成，包含235例男性和128例女性，随访率为94.0%。

1.5 统计学方法 所有统计分析使用SPSS 17.0统计软件进行。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，3组间比较采用单因素方差分析；计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。基因型和等位基因频率的组间区别分析采用卡方检验。对两组的基因型分布频率进行Hardy-Weinberg分析。通过计算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）表示相对危险度，通过Logistic回归分析缺血性卒中危险因素、PAF-AH基因多态性与缺血性卒中的关系，多元生存分析缺血性卒中患者预后与不同基因型的关系。P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 基线资料 两组患者在年龄、性别、体重指数方面比较差异无显著性。试验组在高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟方面较对照组差异具有显著性。试验组血清PAF-AH水平明显高于对照组，差异具有显著性（P＜0.01）（表1）。

2.2 V279F多态性与缺血性卒中及其亚型的相关性 V279F多态性的基因型和等位基因频率在试验组和对照组中的分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性（试验组c2=2.564，P=0.124，对照组c2=0.058，P=0.813），无选择偏倚。试验组各亚组经Hardy-Weinberg平衡检验均达到遗传平衡。由于FF基因型例数较少，将其并入VF基因型与VV基因型进行比较。显性模型VF+FF基因型在试验组表达频率明显高于对照组，差异具有显著性（OR 1.47，95%CI 1.07～2.02，P=0.02）。V279F中的VF基因型在试验组表现率较高（28.8%，OR 1.43，95%CI 1.03～1.98，P=0.03）。而V279F中的F等位基因频率在试验组明显高于对照组（OR 1.42，95%CI 1.07～1.89，P=0.02）。使用Logistic回归对高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、高脂血症、吸烟、饮酒因素进行校正后，V279F中的VF+FF基因型及F等位基因与缺血性卒中仍显著相关（两者分别为OR 1.43，95%CI 1.02～2.00，P=0.042；OR 1.42，95%CI 1.01～2.00，P=0.042）（表2）。

据TOAST分型标准分型后，VF+FF基因型及VF基因型与LAA性卒中显著相关，对血管危险因素进行校正后该关联性依然存在（两者分别为OR 1.73，95%CI 1.18～2.55，P＜0.01；OR 1.67，95%CI 1.13～2.48，P=0.012）。而SAO性卒中与各基因型及等位基因频率无显著相关性（P＞0.05）（表2）。

表1 两组临床基本资料特征比较

表2 V279F基因型和等位基因分布

2.3 V279F各基因型与缺血性卒中复发的关系 363例缺血性卒中患者完成随访，随访率94%，多元回归分析显示失访患者与随访患者基本临床数据相似，包括血管危险因素、既往病史、治疗及基因型分布等（表1）。Cox回归分析显示V279F基因型与缺血性卒中患者复发相关。其中VF+FF基因型与缺血性卒中复发相关性强（HR 1.75，95%CI 1.03～2.29，P=0.041）。缺血性卒中各亚型复发率与V279F基因型分析显示，LAA性卒中与VF+FF基因型相关（HR 1.84，95%CI 1.13～2.41，P=0.037），而SAO性卒中复发与各基因型无显著相关性（表3）。

表3 各基因型Cox回归生存分析

3 讨论

1996年，Stafforini等[14]发现日本人中PAF-AH基因V279F的一个活性部位的缺失性突变导致PAF-AH催化活性下降，此后在不同种族人群中开展了许多关于PLA2G7基因V279F是否与冠状动脉粥样硬化性心脏病相关的研究。Li等[15]发现在中国汉族人群中，V279F与冠状动脉粥样硬化性心脏病发病相关，且等位基因F升高与冠状动脉粥样硬化性心脏病密切相关，这与Yamada等[16]在日本人群中的发现一致。然而，在韩国的Jang等[14]发现V279F升高确导致冠状动脉粥样硬化性心脏病发病率下降。因冠状动脉粥样硬化性心脏病与缺血性卒中具有相似的发病危险因素及发病机制，研究发现V279F与缺血性卒中相关，Hiramoto等[17]对日本人群住院缺血性卒中患者进行研究，先后收集120例缺血性卒中患者及134例无卒中者作为对照，对两组人群抽取血液样本进行PCR试验，分析V279F位点各基因型及等位基因在两组人群中的差异，发现FF+VF基因型和F等位基因频率与缺血性卒中有关。本研究中，V279F基因位点的FF+VF基因型，VF基因型和F等位基因频率均与潍坊地区汉族人群缺血性卒中的发病相关，在对卒中相关危险因素进行校正后，该相关性依然存在，与Hiramoto等研究结论一致。而Liu等[18]对中国东北地区的汉族人群缺血性卒中与PLA2G7基因多态性进行病例对照研究，入组卒中患者非急性卒中，发现V279F基因多态性与中国汉族人群缺血性卒中发病无关。对于这种不同，基因遗传性可能是重要的因素，而本研究对照组中V279F基因型频率（72%VV，26%VF和2%FF）均与Liu等所研究中国东北地区人群不同（88%VV，11%VF和1%FF）。

对PLA2G7基因V279F与缺血性卒中的相关性可作如下解释：数项研究报道PAF-AH活性与缺血性卒中相关。鹿特丹前瞻性研究发现PAF-AH水平与缺血性的发病密切相关[19]。Bruneck研究也发现PAF-AH活性与缺血性卒中相关[20]。一篇meta分析对PAF-AH与缺血性卒中的关系进行了总结[21]，在校正了传统危险因素后，PAF-AH相关危险因子与缺血性卒中密切相关。

对V279F基因位点与缺血性卒中不同分型的关系，本研究发现，V279F基因位点与LAA性卒中存在显著相关性，而与SAO性卒中无显著相关性，可能是由于PAF-AH基因与动脉粥样硬化相关。溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine-PC）是PAF-AH最重要的代谢产物，它在炎性细胞因子的生成及黏附分子的诱发过程中起重要作用，对巨噬细胞起到趋化因子的作用，并导致血管平滑肌增生。且溶血卵磷脂可对PAF-AH的生物活性进行修饰，导致恶性循环进而促使炎性介质大量生产，从而促进动脉硬化过程。PAF-AH的另外一种代谢产物氧化型脂肪酸，可以通过提高氧化应激水平，在血浆中及血管壁中生成氧化型低密度脂蛋白及其他脂蛋白从而促进动脉硬化过程[22]。

对于PAH-AF基因多态性位点与动脉硬化性疾病复发的关系，Maiolino等[23]研究发现PAF-AH基因多态性位点rs1805017与冠状动脉粥样硬化性心脏病患者发生急性心肌梗死等心血管事件相关。Tsai等[24]发现中国台湾地区人群中血浆PAF-AH水平与急性缺血性卒中复发相关，本研究发现V279F位点与缺血性卒中复发相关，与LAA性卒中关系更为密切，为缺血性卒中复发独立的预测因素。

总之，本研究发现，PAF-AH基因中V279F多态性位点可能与缺血性卒中的发病有关，该关联性不依赖于其他常见卒中危险因素，可作为卒中易感性基因预测标记，对卒中的复发提供独立的新的预测基因因素，对卒中的预防和治疗提供新的基因靶点。然而，该研究有许多局限性，如样本量偏少，病例来源范围小等。因此，更大样本量的在不同种族人群中的关于PLA2G7基因多态性与缺血性卒中研究可能会有更多的发现。

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【点睛】本研究分析发现血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性V279F与缺血性卒中易感性及复发相关。