肉鸡盲肠中芽孢杆菌的分离、筛选与鉴定

■王 津 马 蕊 韩 烨郭晓倩周志江郑成江范 寰

（1.天津大学，天津300072；2.天津师范大学生命科学学院，天津 300384；3.天津市畜牧兽医研究所，天津300384）

近年来研究发现，由于抗生素过量和不合理的使用导致动物体内药物残留、细菌的耐药性不断增强等问题，给畜禽业及人类健康造成严重危害。抗生素虽可以抑制病原菌，但对动物体内的益生菌有抑制作用，从而破坏了动物肠道内的微生态平衡。寻找新的替代品以取代抗生素在动物防病及促生长方面的作用，以减少甚至取代抗生素的应用是目前的研究热点。

益生素又被称为微生态制剂，是一类能够维持肠内菌群生态平衡，对机体起有益作用的活的微生物制剂。它可直接通过增强动物对肠内有害微生物的抑制作用或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进动物生长或提高饲料转化率。国内外许多研究表明，微生态制剂对平衡动物肠道菌群和改善肠道微生态、环境等方面具有十分重要的作用，对家禽消化道疾病（如沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性疾病）均有十分显著的防治作用。

微生态制剂用于提高动物生产性能和健康水平，效果差异较大，原因之一就是菌株定植的宿主特异性。因此，理想的微生态制剂菌株最好来自于同源动物的肠道，只有这样才能增强益生菌功效。本研究目的是从肉鸡盲肠内分离出芽孢杆菌，并围绕菌株的形态、抑菌性能、耐酸性和耐胆盐性等几个方面进行了益生菌株的筛选，为今后开发安全、有效的微生态制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 培养基

NB培养基用于培养芽孢杆菌，配方如下：蛋白胨1 g、牛肉膏0.3 g、氯化钠0.5 g、蒸馏水100 ml，pH值7.0。

LB培养基用于培养抑菌试验中的指示菌大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌，配方如下：大豆蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、氯化钠1 g、蒸馏水100 ml，pH值7.0。

1.2 指示菌

大肠杆菌（Escherichia coli）和鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum）由天津市畜牧兽医研究所保存。

1.3 芽孢杆菌的分离

用75%酒精消毒鸡体表面，剪断气管和颈动脉，使鸡迅速死亡。然后用干净的载玻片刮取盲肠内容物样品0.5 g，添加到装有4.5 ml无菌生理盐水的试管中，用涡旋式混匀器使其充分混合均匀。将此原液放于100℃水浴锅中加热10 min杀死非芽孢的微生物，之后将该原液加入到45 ml NB液体培养基中，37℃富集培养20 h。取富集培养后的菌液500 μl到4.5 ml无菌生理盐水中进行梯度稀释，依次梯度稀释至 10-6。分别取 10-4、10-5、10-6稀释度的样品100 μl，滴到NB琼脂培养基平板上，用涂布棒将其涂布均匀，放入37℃恒温培养箱培养18 h，挑取5株单菌落，反复划线纯化到获得纯菌株为止。将纯化好的菌落进行菌落形态观察，革兰氏染色和镜检。

1.4 抑菌试验

采用牛津杯法对筛选出的芽孢杆菌菌株进行抑菌活性测定。将指示菌大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌按1%（v/v）接种量分别接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养24 h备用。将芽孢杆菌菌株发酵液以1%（v/v）接种量接种于NB液体培养基中，37℃恒温培养18 h备用。取灭菌培养皿，注入灭菌的NB固体培养基15 ml，水平放置使之凝固，作为底层。放入已灭菌的牛津杯，将含有200 μl指示菌的20 ml的LB半固体培养基混匀倒入平板，冷凝后取出牛津杯。在孔中加入50 μl芽孢杆菌菌液，放置在4℃扩散4 h，37℃恒温培养24 h后，测量抑菌圈直径，每个处理三个重复试验。

1.5 耐酸和耐胆盐试验

参见王津等（2014）的方法。

1.6 16S rDNA鉴定

1.6.1 细菌DNA的制备和扩增

将筛选出的芽孢杆菌接种于NB液体培养基中，37℃振荡培养18 h。取1.5 ml培养液于离心管中，12 000 r/min离心30 s，弃上清，收集菌体进行DNA的制备和PCR扩增。

1.6.2 扩增产物的电泳分析

以1倍TAE缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶。取PCR扩增产物5 μl，加入溴酚蓝指示剂，混匀后加样。100 V电泳30 min，溴化乙锭染色20 min，紫外灯下观察电泳结果。

1.6.3 测序及序列比对

扩增出鉴定细菌的16S rDNA片段，PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行纯化和测序后做 Blast分析，并在 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中比对，获得鉴定结果。

2 结果

2.1 形态特征

试验共分离了5株疑似芽孢杆菌菌株，分别标记B1、B2、B3、B4、B5。疑似芽孢杆菌的单菌落呈圆形，直径4～5 mm，乳白色，表明呈褶皱状，边缘为锯齿状，质地黏稠，革兰氏染色均为阳性，杆状。

2.2 抑菌试验

菌株对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌的抑制作用结果见表1。由抑菌试验结果可以看出，所筛选的菌株均对大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌有一定的抑制作用。对大肠杆菌抑菌圈直径在10.77～16.99 mm，而对鸡白痢沙门氏菌抑菌圈直径在11.24～17.36 mm。挑选出对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌抑菌圈直径均超过15.00 mm的菌株，分别为B3、B4、B5，进行下一步的耐酸试验。

表1 菌株对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌的抑制作用

2.3 耐酸试验

鸡胃中pH值很低，一般为2.0～3.0。因此益生菌必须具有较强的耐酸能力，才能通过高酸性的胃环境而达到肠道发挥作用。本试验考察2 h内不同pH值条件下B3、B4、B5菌株的存活率，结果见表2。除了B3外，B4、B5菌株均表现出了较强的耐酸能力。pH值4.0处理后存活率分别为63.42%和87.01%；pH值3.0处理后存活率分别为41.34%和59.99%；pH值2.0处理后存活率分别为30.22%和40.02%。因此，挑选出B4、B5进行下一步的耐胆盐试验。

表2 不同pH值条件下菌株的存活率（%）

2.4 耐胆盐试验

小肠内胆盐浓度在0.1%～0.3%。因此，益生菌必须具有较强的耐胆盐能力，才能通过小肠内胆盐的高渗透压环境。本试验2 h内不同胆盐浓度条件下B4、B5菌株的存活率，结果见表3。B5表现出了较强的耐胆盐能力，0.1%处理后存活率为82.34%，0.2%处理后存活率为70.18%，0.3%处理后存活率为48.77%。因此，将菌株B5进行16S rDNA鉴定。

表3 不同胆盐浓度条件下菌株的存活率（%）

2.5 16S rDNA鉴定

分离菌株基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图1）。由图1可知，分离的芽孢杆菌菌株得到一条清晰的条带，与Marker相比，所获得的扩增片段大小在1 500 bp左右，说明所得PCR产物为目的产物，可以纯化后进行测序。将菌株的16S rDNA序列输入到GenBank中，寻找与其同源性最高的菌株。菌株B5与Bacillus amyloliquefaciens的16S rDNA序列的同源性达到了99%。最终确定菌株B5为解淀粉芽孢杆菌。

图1 PCR产物电泳图

3 讨论

传统的微生物鉴定方法是从菌落观察及一系列复杂的生理生化试验来判断，具有耗时长、易干扰、误差大等缺点。而分子生物学鉴定技术从基因水平对菌株进行鉴定，具有精确、快速的优点。本试验从盲肠筛选出一株芽孢杆菌菌株，进行16S rDNA鉴定，经同源性比较分析确定为解淀粉芽孢杆菌，同源性达到99%。

益生菌作为微生态类的饲料添加剂在畜禽养殖业的应用已经越来越普通。然而，其理论上的种种优越性能在生产上表现的效果却常常不尽如人意，究其原因，与益生菌菌株的来源有很大的关系。大量研究指出，采用与原宿主、原生态环境和原微生态系统相适应的同源动物肠道菌群作为益生菌菌株是最为理想的。芽孢杆菌利用氧气的能力很强，它们在肠道定植后，能大大消耗肠道内的氧气，造成厌氧环境，使得肠道内的优势菌群——厌氧菌大量繁殖。芽孢杆菌能形成特殊的休眠体芽孢，在饲料加工过程及进入动物消化道经受各种不利因素的影响方面，具有比乳酸菌更强的抗逆性和耐受性，而且营养要求也很简单，具有明显的生产优势。因此，本试验以鸡的盲肠作为来源，进行芽孢杆菌菌株的分离、筛选和鉴定。

微生态学理论认为，要保证经口服方法饲喂的益生菌能够对动物产生各种益生效应（增强免疫力、预防腹泻、拮抗病原微生物等），先决条件是益生菌能够在经过胃部到达消化道后段时还保持着较多的活菌数。因此，益生菌必须具备耐受胃中的低pH值，才可能进入动物消化道后能够存活、繁殖，发挥其益生作用。经过了胃部的极端酸性环境之后，益生菌还需要耐受小肠中胆汁形成的高渗透压环境。本试验筛选出的B5菌株有较强的耐酸和耐胆盐能力。而芽孢杆菌在较低pH值环境下仍能正常萌发和生长繁殖，原因可能是在酸性环境中，芽孢杆菌通过调节自身膜壁的渗透压，阻止氢离子进入细胞；或当氢离子进入细胞后，用钠氢泵反向协助运输将氢离子排出，使细胞内pH值保持中性。

4 结论

试验通过抑菌、耐酸、耐胆盐试验，从肉鸡盲肠中筛选出了1株芽孢杆菌菌株。经16S rDNA序列同源性比较分析，最终鉴定为解淀粉芽孢杆菌，为今后研究与开发益生菌剂奠定了理论基础。

（参考文献14篇，刊略，需者可函索）