以葡聚糖为载体亮氨酸修饰的磁共振造影剂合成

□ 张晓辉

葡聚糖是由葡萄糖聚合而成的一类水溶性多聚糖。它由于具有分子量大、分布的范围比较广、没有毒性、水溶性好、具有一定的降解作用、有着良好的生物相容性以及能够在血液中长时间停留的特点。将大分子葡聚糖与常用的小分子造影剂Gd-DOTA，Gd-DTPA连接，能够大大提高在临床医学上的弛豫效率与水溶性。

一、实验部分

(一)仪器与试剂。仪器:用质谱测出分子结构，红外光谱仪，KBr压片。在核磁谱仪上测出水分子氢核的弛豫时间(T1)。样品在冻干机上冻干。试剂:四氮杂环十二烷，氯乙酸，氢氧化钾，甲醇，EEDQ，乙二胺，乙二胺四乙酸二钠，亮氨酸，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，葡聚糖，均为分析纯。

(二)DOTA-OSSu活性酯的合成。将3g的DOTA溶于15ml去离子水中，在 5°C 以下加入 2．0g EDC·HCl和 1．5g sulfo-NHS反应24小时，活化50min后得到DOTA的活性酯DOTA-OSSu。

(三)以葡聚糖为载体的 MRI造影剂的合成。Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU的合成路线

1．羧甲基葡聚糖的合成(CMD)。根据参考文献合成CMD，将2g葡聚糖溶于12mL 6 mol·L-1的NaOH溶液中，在0°C条件下搅拌40min后加入20mL异丙醇和4g一氯乙酸，将温度升到65°C后搅拌120min，减压抽滤除去异丙醇溶剂，用截留分子量为6000～8000的透析袋透析4天，将所透析的溶液在60°C条件下旋转蒸发至小体积，冻干后得到CMD。

2．CMD与亮氨酸酰的胺化反应(CMD-LEU)。将2g羧甲基葡聚糖溶于10ml去离子水中，在5°C下加入1g活化剂sulfo-NHS和2g脱水剂EDC·HCl，活化50min。将亮氨酸溶于10ml去离子水中，用1mol/L NaOH调节pH到8，滴加到被活化的羧甲基葡聚糖溶液中，反应24小时。用去离子水透析四天，将透析后的溶液于60°C旋转蒸发至小体积冻干，得到CMD-LEU。

3．CMD-LEU与乙二胺的酰胺化反应(CMD-LEUEDA)。将2g CMD-LEU溶于5ml去离子水中，配制2mol/L的HCl调节溶液pH到3。准确称量2．4g EEDQ溶解在6ml甲醇溶液中，50min后将6ml甲醇溶液滴加到CMD-LEU溶液中，在25°C水浴中搅拌50min后加入6ml乙二胺反应5小时。反应结束后加入50ml甲醇溶液，出现白色沉淀，放于冰箱中过夜，抽滤收集白色沉淀，加入2ml去离子水透析四天后冻干。

4．CMD-LEU-EDA修饰的DOTA大分子配体的合成(DOTA-EDA-CMD-LEU)。将4g DOTA溶于10ml去离子水中，在60°C条件下搅拌溶解，加入2g活化剂sulfo-NHS和1g脱水剂EDC·HCl，活化50min，将2g CMD-LEU-EDA溶于12ml去离子水中，用胶头滴管将CMD-LEU-EDA滴加到DOTA的活化酯中，在5°C条件下反应24小时，透析4天后冻干。

5．CMD-LEU-EDA修饰的Gd-DOTA配合物的合成(Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU)。将CMD-LEU-EDA溶于10ml去离子水，加入20ml 2．49*10-2mol/L的 GdCl3溶液，在25°C水浴中搅拌24小时，用1mol/L的NaOH溶解调节pH到6，反应完毕后先不要停止反应，加入两滴二甲基酚橙溶液做指示剂，用5mol/L的EDTA进行络合滴定，滴加至二甲基酚橙溶液由红色变为明黄色为止。

图1 (a)Dextran(b)CMD(c)CMD-LEU(d)CMD-LEU-EDA(e)CMD-LEU-EDA-DOTA的红外图

(四)以葡聚糖为载体的MRI造影剂的表征。在葡聚糖T-40的红外谱图中，3200～3650cm-1范围内产生H-O的伸缩振动吸收峰，谱带较强。在1647cm-1附近出现的比较的强尖峰是多糖中结晶水的吸收峰，与葡聚糖T-40的红外谱图相对比，CMD在1600cm-1附近出现了COO-的振动吸收峰，说明葡聚糖T-40发生羧甲基化反应得到了产物CMD。高波数1658cm-1附近出现的峰为酰胺键的吸收峰，证明成功连接上亮氨酸。从1668cm-1附近出现的酰胺键的吸收峰可以得出乙二胺被顺利连接上了。因为DOTA的加入，在1672cm-1附近出现DOTA中的COO-的振动吸收峰。由此可以得出DOTA的确是通过酰胺键连到了葡聚糖分子上。

图2 Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU的弛豫效率

(五)以葡聚糖为载体的MRI造影剂的体外弛豫测定。将大分子的葡聚糖和小分子造影剂Gd-DOTA相结合，增加了旋转相关时间，提高了造影剂的弛豫效率。由图2可知Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU 在0．5～0．05mmol/L的浓度范围发生变化时，溶剂氢核的弛豫效率也发生变化。出线性拟合，相关系数r为0．99913，它的弛豫效率为5．5mmol-1·L·s-1。如今，临床医学所使用的Gd-DOTA造影剂的弛豫效率 4．8mmol-1·L·s-1，Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU 的弛豫效率是Gd-DOTA的1．1倍。

二、结语

本实验通过酰胺化反应合成了Gd-DOTA-EDA-CMD-LEU这种造影剧毒性小，水溶性好，且有一定的降解作用，其弛豫效率是小分子弛豫效率Gd-DOTA的1．1倍。这种造影剂有着良好的发展前景，但是在体内的药物代谢的分布仍需要进一步研究。

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