心脏干细胞研究进展与临床应用

DOI：10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2015.03.17

基金项目：国家自然科学基金（81200151，81200708）；“十二五”国家科技支撑计划（2011BAI11B20）；陕西省科技统筹创新工程项目（2013KTCL03－01）

作者单位：710032西安，第四军医大学第一附属医院心血管外科（孙　萌、段维勋、刘金成、俞世强、梁宏亮、金振晓），邮编城市名，山西医科大学第一医院心脏内科（孙　萌）

通讯作者：梁宏亮，Dr.lianghongliang@hotmail.com

1　背景

传统学术观点将心脏定义为一种终末分化的“静止”器官，因检测不到进行有丝分裂的心肌细胞，所以认为心脏在人出生后就无法再生出新的心肌细胞，心肌组织处于永恒的生长阻滞中。然而也有科学家提出：假如心肌细胞不能够再生，那么出生后不断生长的心脏，或由疾病造成的心脏质量与体积的增加就只能够通过单个细胞质量与体积增加（细胞肥大）解释。但研究表明单细胞的质量、体积变化总和远不能和整体心脏的质量、体积变化匹配。事实上，心脏生长的原因不只是心肌肥大，更多是由心肌细胞数量增加造成的 ［1］。2009年Science报道科学家使用同位素标记方法证明：人类每年心肌细胞以1%左右的速度进行更新，健康人一生中约45%的心肌细胞来源于后天再生 ［2］。因此，虽然心肌细胞极少有丝分裂，但成体心脏一定存在新生心肌细胞来源。研究显示心脏中存在一定数量的具有自我更新与分化能力的心脏干细胞（cardiac stem cells，CSCs）是心肌细胞再生的重要来源 ［3］。这颠覆了心脏是终末分化的“静止”器官的旧观点，表明心脏可自我更新、再生。也使人们逐渐认识到CSCs在心脏生理稳态维持与病理再生修复中的关键作用，令研究CSCs成为国际热点。特别是Lancet报道已将CSCs应用于缺血性心脏的临床治疗，取得了良好疗效，为此类患者的治疗带来了新的希望 ［4－5］。本文就CSCs的基本性质与临床应用做以综述。

2　心脏干细胞的分类与来源

Bergmann研究 ［2］发现在年轻人心肌细胞更新率为1%／年，老年人0.5%／年。CSCs理论上是心肌再生和间质细胞再生的来源之一。CSCs具有自我更新、克隆形成、多种分化潜能干细胞的特性，并且在体内、外能分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。据CSCs表面的标志和来源不同CSCs可分为：c－kit ＋／Lin CSCs ［6］、Sca－1 ＋CSCs ［7－8］、lsl1 ＋CSCs ［9］、侧群CSCs（the cardiac side population） ［10－11］、SSEA－1 ＋CSCs ［12］、心外膜来源干细胞（Epicardium－derived cells） ［13］等类型。这些不同种类的CSCs之间存在一定的交叉，表达不同标志物的CSCs可能是同一种CSCs，或是CSCs发育不同阶段表达的不同标志物，也可能是不同的CSCs特有的标志。Quaini等 ［14］通过性别错配心脏移植的实验研究，认为心脏干细胞来源于骨髓。但随着研究的进一步深入，大量的实验结果显示CSCs来自心脏，成体心脏存在心脏干细胞巢 ［15］。CSCs可被发现于心房、心室、房室沟、心外膜 ［16－18］，但分布不均匀，分布与组织所承受的压力成反比 ［19］，心房多于心室 ［20］。Itzhaki－Al⁃fia等 ［21］的研究显示从患者右心耳分离出来的ckit ＋CSCs多于心脏其他部位。

3　心脏干细胞的分离与扩增

分离、培养获取可用于治疗的足够数量CSCs是临床应用的主要瓶颈之一。目前分离CSCs主要包括经皮心内膜心肌活检法和外科手术法。外科手术方法最常获取右心耳组织，相对安全，c－kit ＋／Lin －CSCs含量较多 ［21］。但由于开胸创伤大，应用比较局限。经皮心内膜心肌活检技术在临床较常应用，创伤性小，安全性高，较易于患者接受，且不易受疾病类型的影响。不足之处是获取组织量相对有限。但随着分离、培养技术的改进，即使少量组织量也能扩增获得治疗量的CSCs ［22］。目前的培养扩增的方法有：在培养基中加入细胞因子，如胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子；培养条件预处理，如缺氧环境下，CSCs开始表达一些利于存活的信号蛋白和生血管因子，如血管内皮生长因子、缺氧诱导因子－1α、CXCR4等 ［23］。Tang等 ［24］研究表明，缺氧预处理提高了CSCs对心肌梗死的疗效。

4　心脏干细胞的移植途径与示踪

CSCs的存在使心脏像肝脏、脑和皮肤组织一样具有再生功能和自我修复能力。在动物急、慢性心肌梗死，缺血性心肌病模型中，自体或异体CSCs经过体外分离、培养、增殖后，可通过不同途径进行移植并具有各自的特点：①静脉内注射：无创且易操作，但细胞输送效率低，大量移植细胞滞留于心脏外组织 ［25］，且CSCs的全身分布与影响不清楚；②心肌内注射：避免开胸，比经动静脉输注所需干细胞数量少，经超声或肌电图引导下经皮以导管为基础的心肌内注射，肌电图可描绘和分辨瘢痕组织及存活的心肌，因此可直达目标部位；但由于采用心脏手术方式的侵入性操作存在术中和术后风险且需特殊导管和影像技术 ［26］；③冠状动脉内注射：可于第一时间内在梗死部位及其周边区域移植最大限度的干细胞，但输送的有效性不确定，有发生栓塞的风险；④开胸心外膜注射：外科手术中在直视下注入CSCs，但创伤较大存在手术风险；注入体内CSCs的示踪方法有：①放射标记物标记后通过PET和SPECT定位；②铁粒子标记，通过MRI观察；③基因标记如生物荧光，进行在体荧光成像。

5　心脏干细胞修复心脏的机制

CSCs具有自我更新，集落生长和多潜能等特性，在心梗动物模型在体实验中显示具有大量再生的潜力 ［27］，能分化成为心肌细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞和血管内皮细胞。目前，c－kit ＋CSCs被认为是心肌再生治疗的最合适的细胞类型。其对心脏稳态的维持及损伤修复的机制可能有以下几个方面：一是直接分化机制 ［24］，c－kit ＋内源性CSCs对损伤的心肌有很强的趋向性，移植到受损心脏后可以分化成心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，通过增加心脏功能细胞的数量或者来自细胞间的协同作用，从而改善心脏功能。有实验证明长期培养CSCs ［28］，可上调GATA－4表达，增强心肌细胞分化能力，证明高表达GATA－4／c－kit ＋CSCs有很强的心脏再生潜力。有研究发现，细胞外基质中的β1整合素可通过MAPK通路调节CSCs的存活，也可以通过Rho及Wnt信号传导影响CSCs分化中Cx40和Cx43的表达。另外，梗死灶边缘的残存心肌细胞可通过细胞间连接与CSCs建立联系，传递终末分化信息，诱导其向心肌方向分化，并有利于实现其与周围心肌同步舒缩。二是通过自分泌和旁分泌机制 ［24］分泌促血管生成及保护心脏的多种生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子1 （IGF－1）、肝细胞生长因子（HGF）、可溶性血管细胞黏附分子1（sVCAM－1）、基质细胞衍生因子1 ［27］。当c－kit ＋CSCs与成熟心肌细胞共同培养时 ［29］，由于上调VEGF、IGF－1表达，通过激活Akt信号通路，可以增加CSCs数量，增强心肌细胞存活能力，当ckit ＋CSCs植入心肌梗死大鼠心脏后 ［28］，可分化成心肌细胞和血管结构，产生许多新的再生心肌，促进心脏功能的修复，从而改善心功能。目前的研究表明，IGF－1和VEGF是特殊的生长因子，可增加培养基营养，从而增强心肌细胞存活能力。其中sVCAM－1 ［30］被认为是主要的旁分泌信号因子之一，通过激活Akt，ERK，p38 MAPK等蛋白激酶诱导内皮细胞和CSCs的迁移及血管生成，在氧化应激的条件下，预防心肌细胞死亡，保护心脏，其在对心脏损伤的修复过程中起关键作用。旁分泌的细胞因子有抗凋亡作用，从而改变细胞外基质，吸引更多内源性CSCs。但细胞直接转化和长期存活非常有限。需要指出的是旁分泌作用包括两个不同的效应：第一个是体液刺激内源性再生，第二个是保护现有的细胞 ［31］。多数实验结果显示c－kit ＋CSCs对心脏稳态的维持及损伤修复机制中的旁分泌作用大于心脏干细胞的直接分化作用 ［27］。此外，活化的CSCs通过细胞融合对损伤的冠脉血管修复也起一定的作用。

6　心脏干细胞的临床应用

CSCs具有定向分化心脏细胞的特性且致瘤率低，自体移植后不存在免疫排斥反应和伦理道德问题且可冻存，重复多次使用。这些特点更适合应用于临床治疗。大量动物实验显示，c－kit ＋CSCs可改善心肌梗死后的左室功能紊乱，生成新的心肌细胞从而增加心肌细胞的数量及局部毛细血管密度，改善局部缺血心肌细胞的血液供应，修复缺血受损的心肌细胞，改善心脏收缩、舒张末期的容积从而抑制心室重构，改善左室射血分数和血流动力学，提高心脏功能，从根本上达到治疗缺血性心肌病的目的。尽管如此，CSCs移植入人体内的有效性还是不太明确的。2009年2月，Bolli等 ［4］人开始了自体CSCs移植治疗缺血性心肌病的Ⅰ期临床试验（SCIPIO）。患者的纳入标准为心肌梗死后、射血分数≤40%且接受过冠状动脉旁路移植手术。实验方法是手术后4个月的患者经冠脉内重新移植从右心耳分离出的自体性心脏干细胞，对照组没有接受治疗。在A阶段，对治疗组的9位患者与对照组的4位患者进行连续性评估自体CSCs移植后的短期安全性和可行性。在B阶段，患者以2∶3的比例使用划分为5块大小的随机性方案纳入治疗组和对照组。纳入后评估其连续时间内的安全性和有效性的终点事件。结果显示81例患者中，80例患者自体性CSCs成功分离并扩增。16位治疗组的患者没有观察到不良反应。三维心脏超声显示移植CSCs后4个月左室射血分数从（30.3±1.9）%增至（38.5±2.8）%，局部室壁运动得到改善，且患者生活质量有了一定的提高。相反地，对照组7位患者在相应的间隔时间内没有明显地改变。更重要的是自体CSCs移植1年后左室射血分数较前提高了（12.3±2.1）%，对心脏功能有更显著的改善作用。7位治疗组的患者通过心脏MRI显像心肌梗死面积在4个月减少了23.8%，1年减少了30.3%。因此，SCIPIOⅠ阶段实验证明通过冠脉内移植自体CSCs治疗缺血性心肌病是可行、安全的，治疗1年后可以明显改善左室收缩功能，取得一定的临床疗效。SCIPIOⅡ阶段需要对自体CSCs移植提供大量的临床数据，为指导临床治疗提供有效的依据。2009年5月，Makkar等 ［5］人开始了（CADUCEUS）自体CSCs移植逆转左室功能紊乱的前瞻性、随机性研究。患者纳入标准为心肌梗死后2至4周且左室射血分数为25%～45%。以2∶1的比例随机分配患者接受自体CSCs移植治疗或标准治疗。Ⅰ阶段实验结果显示自体CSCs移植24 h后没有并发症，治疗6个月后射血分数提高且没有患者死亡或发展心脏肿瘤等副作用。自体CSCs移植治疗6个月，12个月后与对照组相比，心脏MRI提示瘢痕质量占左室质量从基础值24%分别减少7.7%，12.3%（P＝0.001），对照组仅减少0.3%，2.2%。同时增加了有效的心脏质量（P＝0.01），局部收缩力（P＝0.02）和局部收缩厚度（P＝0.015）。提示自体CSCs移植治疗后可以减少心肌梗死面积，刺激健康心肌组织的再生长的同时改善局部室壁运动。虽然有两项临床研究证明骨髓干细胞治疗可以减少心肌梗死面积，但CSCs治疗比其治疗效果更明显。尽管如此，CSCs治疗的有效性仍需要大规模的临床研究。

7　结语

虽然针对CSCs已有大量的动物实验研究，但目前的结果并不能满足临床的需要，还有很多问题有待解决：CSCs是否受到疾病状态的影响？CSCs在不同分化阶段是同一细胞类型吗？CSCs的移植方式和最佳时机的选择？CSCs自身的稳态平衡及动态变化是如何调控的？如何使用有效的方法获得足够数量的高纯度CSCs？如何提高CSCs移植后的存活率、增殖能力及分化率？如何最有效地追踪CSCs移植后的命运？目前对于CSCs治疗缺血性心肌病的机制存在争议，更多证据倾向于旁分泌机制，但具体的信号通路及作用机制有待进一步探讨和完善。虽然有大量的动物实验证明自体CSCs移植具有广阔的临床应用前景，但开展的临床试验仍较少且观测时间不够长，缺少大样本量的临床试验，这些都需要更进一步的研究和论证。