血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂在大鼠放射性心脏损伤中保护作用的研究

吴荣，马天馨，曾越灿

（中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤病房，沈阳110022）

血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂在大鼠放射性心脏损伤中保护作用的研究

吴荣，马天馨，曾越灿

（中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤病房，沈阳110022）

目的 探讨氯沙坦在放射性心脏损伤中的保护作用，以及对核因子κB（NF-κB）及血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1）表达的影响。方法SD大鼠75只，共分为5组。空白组：不接受任何干预；照射+安慰剂组：接受18 Gy照射+安慰剂干预；单独给药组：接受氯沙坦10 mg·kg-1·d-1干预；照射+氯沙坦a组：接受18 Gy照射+氯沙坦10 mg·kg-1·d-1干预；照射+氯沙坦b组：接受18Gy照射+氯沙坦20 mg·kg-1·d-1干预。采用超声心动图检测左室射血分数变化；采用HE及Masson染色观察大鼠心肌损伤情况；采用免疫组化观察AT1及NF-κB在心肌组织中的分布情况；采用蛋白免疫印迹杂交及RT-PCR检测AT1及NF-κB蛋白及mRNA的表达情况。结果超声心动图显示受照射大鼠左室射血分数降低；HE及Masson染色显示受照射大鼠心肌细胞出现变性，坏死，心脏组织出现明显纤维化；大鼠给予氯沙坦干预后，受照射大鼠的心脏损伤减轻，心脏组织纤维化减轻，心功能损害减少；免疫组化提示，照射后大鼠心肌及内皮细胞中AT1受体及NF-κB表达较空白组及单独给药组明显，照射+氯沙坦组的AT1受体及NF-κB表达较照射+安慰剂组少；Western blot及RT-PCR提示，接受氯沙坦干预的受照射大鼠，AT1蛋白及mRNA表达水平被明显的抑制；接受氯沙坦干预的受照射大鼠，NF-κB蛋白及mRNA表达水平被明显的抑制。结论氯沙坦在放射性心脏损伤中具有保护作用，可能是通过下调AT1及NF-κB的表达来实现对放射性心脏损伤的保护作用。

放射性心脏损伤；氯沙坦；血管紧张素Ⅱ1型受体；核因子κB

胸部放射治疗是诸多胸部恶性肿瘤的主要治疗措施之一。20世纪90年代，人们认识到心脏并非放射耐受器官，多种形式的心脏疾病都与胸部放射治疗有关［1］。在乳腺癌治疗中，放疗成为重要的治疗手段之一，但是其带来的心脏放射性损伤（radiation-induced heart disease）成为乳腺癌死亡率增高的重要原因，心脏放射性损伤是值得重视的［2］。曾经公认放射治疗低于40 Gy的照射是安全的，而如今看来即使是低于安全剂量的放疗同样可以引起心脏损伤，并且会引起一系列的放射性心肌疾病［3，4］，放射性心血管疾病是影响这些幸存病人预后的重要危险因素［1，4］。

血管紧张素Ⅱ和醛固酮是肾素—血管紧张素—醛固酮系统的重要组成成分，在动脉粥样硬化、高血压、心脏肥大、心肌和基质纤维化等心血管疾病的形成中起着重要的病理生理作用［5，6］。血管紧张素Ⅱ和醛固酮通过刺激一些生长因子、血管收缩因子的生成，发挥着先导炎性介质的作用，同时跨途径激活多种生长因子受体，影响正常细胞功能［7～9］。放射性心肌病病征先是微血管的损伤，然后是心肌缺血，最后发展为纤维化。放射性心肌疾病通常会表现为一系列的心脏疾病，其中心包及心肌的纤维化最为显著。我们前期的研究提示，血管紧张素II-醛固酮在放射性心脏损伤中起重要作用［6］。

核因子κB（NF-kappaB，NF-κB）在多种心肌疾病和心肌损伤中均存在着活化现象，是启动、放大和延续心肌炎性反应过程中的关键性转录因子，P65（RelA）是其重要的功能亚单位。大量研究证明，血管紧张素Ⅱ在心血管细胞肥大、增殖、迁移、细胞外基质增生，纤维化的过程中，对NF-κB的激活是一个重要途径［10］。

血管紧张素Ⅱ1型受体是血管紧张素-醛固酮系统的重要组成部分。氯沙坦作为血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂，发挥降压作用机制是通过选择性阻断血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1）［11］。氯沙坦可以阻断任何来源或任何途径合成的血管紧张素Ⅱ所产生的相应的生理作用，与其他肽类的血管紧张素Ⅱ拮抗剂相比，氯沙坦无激动作用。有研究也发现，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂具有保护内皮、抑制血小板聚集、抑制炎性基因表达和改善左心室重构等作用［11，12］。

RHID目前尚缺乏有效的治疗方法，前期研究证实血管紧张素Ⅱ-醛固酮在放射性心脏损伤中起重要作用的基础上，本文拟研究氯沙坦在放射性心脏损伤中的保护作用，以及对NFкB及AT1受体表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组及干预

SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠75只，雌雄各半，月龄3个月，体质量（178～245）g，购于中国医科大学实验动物中心。将75只大鼠应用随机数字表法随机分为5组，每组15只。空白组：不接受任何干预；照射+安慰剂组：接受18 Gy照射+安慰剂干预；单独给药组：接受氯沙坦10 mg·kg-1·d-1干预；照射+氯沙坦a组：接受18 Gy照射+氯沙坦10 mg·kg-1· d-1干预；照射+氯沙坦b组：接受18 Gy照射+氯沙坦20 mg·kg-1·d-1干预。大鼠给予水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后心脏彩超定位，放置于直线加速器下照射。使用6 MV高能X射线，采用前后对穿照射的方法，源皮距100 cm，心脏彩超扫描确定照射野大小，照射剂量300 cGy/min。照射完后6 h之内，除空白组外，对所有鼠行第一次灌胃处理，照射+安慰剂组灌入2 mL蒸馏水，氯沙坦及照射+氯沙坦组分别灌入相应量的氯沙坦。此后每天灌胃1次，每7 d测量1次体质量，根据体质量调整灌药量，行灌胃处理30 d，分笼饲养至3个月。

照射后3个月标本取材，用水合氯醛过量麻醉法处死大鼠，取其心脏组织，用生理盐水洗净血液后，用剪刀将其横断，一半迅速放于4%中性甲醛固定液中固定，48 h后转入70%乙醇中保存；另一半放入-80℃深冻冰箱中保存。

1.2 检测指标

1.2.1 实验前后大鼠心脏功能变化：大鼠给予水合氯醛腹腔注射麻醉后，超声心动图检测大鼠左室射血分数（LVEF）的变化。

1.2.2 心肌组织HE、Masson染色观察心肌损伤及纤维化情况，免疫组织化学观察AT1、NF-κB表达：HE染色过程：将保存于70%乙醇中的心肌组织取出，小心取下一约5 mm×5 mm×5 mm大小的心脏横断面组织放入包埋盒中，经过脱水、透明、浸蜡、包埋后制成组织蜡块，在切片机上连续切成厚度约4 μm的组织切片，捞片，放入60℃烤箱中烘干备用。将片子放入100%二甲苯中脱蜡10 min×2次，用无水乙醇洗去二甲苯4 min，后用95%、80%、70%乙醇各洗1 min，PBS和蒸馏水各冲洗1 min。HE特殊染色0.2%醋酸水溶液洗10 s，5%磷钨酸10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，2%苯胺蓝液染色5 min，0.2%醋酸水溶液洗2次，梯度乙醇脱水二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察心肌细胞等损伤情况。Masson染色过程：常规石蜡切片脱蜡后，行Masson染色，光镜下观察心肌细胞呈红色或黄色，胶原纤维呈蓝绿色，拍片，扫描，采用图像分析仪测定心肌组织胶原含量。免疫组化过程：SP法免疫组化染色，染色步骤按说明书进行，抗体的工作浓度为1∶100。用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，用预试验中已知的阳性片作阳性对照。

1.2.3 蛋白免疫印迹杂交（Western blot）法检测AT1、NF-κB表达。提取大鼠心肌组织蛋白并测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗（小鼠抗AT1、NF-κB单克隆抗体）（1∶3 000）孵育PVDF，4℃过夜；1×TBST洗5 min×5次；将二抗（HRP标记山羊抗鼠IgG抗体）（1∶2 000）室温孵育2 h；1×TBST洗5 min×5次；ECL显影；以GAPDH作为内参照物，相同实验重复3次。

1.2.4 RT-PCR（实时荧光定量逆转录聚合酶链反应）法检测AT1及NF-κB mRNA表达水平。AT1上游引物：5′-CACCTATGTAAGATCGCTT-3′，下游引物：5′-GATGATGATGCAGGTGACT-3′，扩增片段长度162 bp；NF-κB上游引物：5′-ACATTACAAAGCCA GCTTCC-3′，下游引物：5′-CTGGCGTTTCCTCTGTA CTT-3′，扩增片段长度128 bp；GADPH上游引物：5′-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′，下游引物：5′-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3′，扩增片段长度177 bp。实验步骤按说明书进行。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 动物模型建立情况

45只大鼠接受了直线加速器对心脏的对穿照射，照射时用铅块（或多叶光栅）挡住除暴露心脏外的其他器官。在饲养过程中，照射+氯沙坦a组有2只大鼠在照射后死亡，照射+氯沙坦b组有1只大鼠在照射后死亡，照射+安慰剂组有1只大鼠死亡；所有经过照射的大鼠都出现体质量下降明显等症状，空白组大鼠无死亡。共有71只大鼠完成实验：空白组15只，照射+安慰剂组14只，单独给药组15只，照射+氯沙坦a组13只，照射+氯沙坦b组14只。

2.2 大鼠心脏功能变化情况

大鼠心脏经18 Gy X射线照射3个月后，超声心动图提示受照射大鼠心功能降低（表1），氯沙坦干预可以降低受照射大鼠心功能损害（P＜0.05）。

表1 大鼠左心室射血分数（LVEF）差值及心脏纤维化评分Tab.1 Mean difference of left ventricular ejection fraction and quantification of myocardial fibrosis

1）compared with other group，P＜0.05；2）compared with other group，P＜0.05.

Group Mean difference of left ventricular ejection fraction Quantification of myocardial fibrosis The blank group 4.53±1.05 0.18±0.08 The single drug group 3.83±1.28 0.15±0.10 The irradiation plus losartan b group 10.99±2.03 1.56±0.45 The irradiation plus losartan a group 13.50±3.18 3.02±0.82 The irradiation plus placebo group 29.45±3.081）6.44±0.792）

2.3 常规HE染色结果

在×100镜下观察，接受照射的大鼠心肌出现较为明显的心肌损伤，心肌细胞排列紊乱，部分细胞出现变性及坏死，细胞核排列不规则，其中照射+安慰剂组损伤较其他照射组重，接受氯沙坦干预的大鼠心肌损伤程度较不接受氯沙坦干预的大鼠要轻。见图1。

2.4 Masson染色结果

照射后大鼠心脏组织纤维化明显（蓝色，图2），照射+安慰剂组纤维化较其他组明显（表2，P＜ 0.05）；接受氯沙坦干预可降低照射所引起的纤维化程度，氯沙坦干预剂量高组这种效果更明显（图2、表1，P＜0.05）。

2.5 免疫组化情况

2.5.1 AT1受体免疫组化结果（图3）：免疫组化提示，照射后大鼠心肌及内皮细胞中AT1受体表达较空白组及单独药物组明显。照射+氯沙坦a组与照射+氯沙坦b组的AT1受体表达较照射+安慰剂组少，提示氯沙坦在放射性心脏损伤中具有保护作用。

2.5.2 NF-κB免疫组化结果：免疫组化提示，照射后大鼠心肌及内皮细胞中NF-κB表达较空白组及单独药物组明显。照射+氯沙坦a组与照射+氯沙坦b组的NF-κB表达较照射+安慰剂组少，提示氯沙坦可降低NF-κB在心脏中的表达，氯沙坦在放射性心脏损伤中具有保护作用（图4）。

2.6 Western blot结果

AT1及NF-κB蛋白表达情况：照射+安慰剂组的AT1及NF-κB蛋白表达较其他组明显（见图5、图6，P＜0.05）；照射+氯沙坦a组的AT1及NF-κB蛋白表达较照射+氯沙坦b组明显（图5、6，P＜0.05），较空白组及单独给药组也明显。提示大鼠心脏接受放射线照射后，AT1及NF-κB蛋白表达升高，氯沙坦干预可降低照射所引起的AT1及NF-κB蛋白表达水平，氯沙坦干预剂量高组这种效果更明显（图5、图6，P＜0.05）。

2.7 RT-PCR结果

照射+安慰剂组的AT1及NF-κB mRNA表达较其他组明显；照射+氯沙坦a组的AT1及NF-κB mRNA表达水平较照射+氯沙坦b组明显，较空白组及单独给药组也明显。提示大鼠心脏接受放射线照射后，AT1及NF-κB mRNA表达水平升高，氯沙坦干预可降低照射所引起的AT1及NF-κB mRNA表达水平，氯沙坦干预剂量高组这种效果更明显（图7，P＜0.05），这一结论与Western blot结果一致。

3 讨论

目前认为放射性心脏损伤是心脏在胸部接受放射治疗的过程中，不可避免地受到不同程度的照射，产生的生理及病理改变。研究证明，大鼠的心脏在（15～20）Gy照射后，放射性心脏疾病在大约（1～3）个月的照射后出现，疾病的严重程度和照射剂量、照射范围、射线种类、个体差异及照射后的时间等相关［3，6，13］。

NF-κB的激活是放射性心脏损伤早期炎性改变的一个关键的步骤，NF-κB是一种控制编码细胞因子、生长因子、细胞黏附分子、化学激活物的转录因子。越来越多的研究已经证明辐射可以激活NF-κ B，它与放射性组织损伤有很密切的关系，在放射性肺损伤中起着刺激前炎性因子产生的作用［14，15］。目前研究表明，血管紧张素Ⅱ诱导炎性反应导致高血压和/或糖尿病的终末器官损伤，主要通过激活NF-κB经典途径引起。在心血管系统中，NF-κB与心肌炎、缺血再灌注损伤、心肌梗死、心衰、心肌肥大以及动脉粥样硬化密切相关［16］。

本研究组［6］前期的研究发现，血管紧张素Ⅱ以及醛固酮与心脏放射性损伤有显著相关性，照射组大鼠心肌组织血管紧张素Ⅱ和醛固酮的表达量明显高于对照组，并有统计学意义，提示血管紧张素-醛固酮很可能参与放射性心肌损伤的形成。而血管紧张素-醛固酮系统与心肌纤维化关系密切，血管紧张素Ⅱ在其中起到了主要的作用。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物能够阻断血管紧张素受体（AT1），避免血管紧张素Ⅱ结合到受体上，起到阻断内源性及外源性血管紧张素Ⅱ的药理作用［11］。血管紧张素Ⅱ可诱导活性氧、细胞因子、黏附分子的产生促进血管壁的炎性反应，使NF-κB受体上调。NF-κB是调节大多数刺激因素所致炎症、应激、增生和凋亡反应的关键转录因子，与心血管损伤、纤维化密切相关［16］。

本研究提示，大鼠心脏经18 Gy X射线照射3个月后，超声心动图提示受照射大鼠心功能降低，HE及Masson染色显示心肌细胞出现变性，坏死，心脏组织出现明显纤维化。非照射组大鼠心肌细胞形态正常，无组织纤维化表现，心功能无明显变化［17～19］。但是，大鼠给予氯沙坦干预后，无论是10 mg· kg-1·d-1或是20 mg·kg-1·d-1，受照射大鼠的心脏损伤减轻，心脏组织纤维化减轻，心功能损害减少。免疫组化提示，照射后大鼠心肌及内皮细胞中AT1受体及NF-κB表达较空白组及单独给药组明显。照射+氯沙坦组的AT1受体及NF-κB表达较照射+安慰剂组少。AT1蛋白及mRNA检测提示，大鼠接受18Gy照射后，照射+安慰剂组大鼠心肌细胞的AT1蛋白及mRNA表达水平高于其他4组；接受氯沙坦干预的受照射大鼠，无论是10 mg·kg-1·d-1或是20 mg·kg-1·d-1，AT1蛋白及mRNA表达水平被明显的抑制了，氯沙坦剂量的升高其抑制趋势更明显，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。同样大鼠接受18 Gy照射后，照射+安慰剂组大鼠心肌细胞的NF-κB蛋白及mRNA表达水平高于其他4组；接受氯沙坦干预的受照射大鼠，无论是10 mg·kg-1·d-1或是20 mg·kg-1·d-1，NF-κB蛋白及mRNA表达水平均被明显的抑制，氯沙坦剂量的升高其抑制趋势更明显，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，我们可以得出这样的结论：氯沙坦在放射性心脏损伤中具有保护作用，其可能通过下调AT1及NF-κB的表达来实现对放射性心脏损伤的保护作用的。NF-κB与AT1在放射性心脏损伤中起重要作用，氯沙坦下调NF-κB的表达可能与AT1的表达下调有关，但是具体通过何种信号通路及机制实现这一调节过程仍需更深入的研究［20］。

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（编辑 裘孝琦）

Protective Effects of Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor Antagonist Losartan in Radiation Induced Heart Injury

WU Rong，MA Tian-xin，ZENG Yue-can
（Department of Medical Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China）

ObjectiveTo investigate the protective effects of losartan in radiation induced heartinjury，and the influence on the expression of NF-κ B and AT1 receptor.MethodsSeventy-five SD rats were randomly divided into 5 groups：the blank group（without any intervention），the irradiation plus placebo group（receiving 18 Gy irradiation plus placebo intervention），the single drug group（receiving only 10 mg·kg-1·d-1losartan intervention），the irradiation plus losartan a group（receiving18 Gy irradiation plus10 mg·kg-1·d-1losartan intervention），and the irradiation plus losartan b group（receiving 18 Gy irradiation plus 20 mg·kg-1·d-1losartan intervention）.HE and Mass on staining were used to observe the myocardial injury.The changes of left ventricular ejection fraction were evaluated by echocardiography.The distributions of AT1 and NF-κ B in cardiac tissue were detected by immunohistochemistry.The expression of AT1 and NF-κB protein and mRNA were determined by western blot and RTPCR.ResultsDecreased left ventricular ejection fractions were recorded by echocardiography in irradiated rats.HE and Mass on staining indicated that the myocardial cells of irradiation rats showed degeneration and necrosis，the heart tissue appeared obvious fibrosis.When the rats were treated with losartan after irradiation，the heart injury，the cardiac fibrosis and the heart function damage decreased.The immunohistochemical staining showed that after irradiation，the expressions of AT1 receptor and NF-κB of myocardial and endothelial cells were more obvious compared with both blank group and the single drug group.The expressions of AT1 receptors and NF-κB of irradiation plus losartan group were less obvious compared with the irradiation plus placebo group.The Western blot and RT-PCR indicated that after the losartan intervention，the expressions of AT1 protein and mRNA of irradiation rats were significantly impaired；the expressions of NF-κB protein and mRNA were significantly suppressed，too.ConclusionLosartan has protective effects on radiation induced heart injury，possibly through down-regulation the expression of AT1 and NF-κB.

radiation induced heart injury；losartan；angiotensin Ⅱ type 1 receptor；NF-κB

R730.5

A

0258-4646（2015）01-0020-07

国家自然科学基金（81201803）

吴荣（1962-），女，教授，博士.

E-mail：wur@sj-hospital.org

2014-09-09

网络出版时间：