一种复合益生菌对斜带石斑鱼生长及免疫特性影响的研究

■李小梅 杨丽冬 张家学 舒 琥 张海发

(1.广州大学生命科学学院，广东广州510006；2.广东海大集团股份有限公司研究院，广东广州511400；3.广东省大亚湾水产试验中心，广东惠州516081)

近年来，斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）已成为我国广东、福建和海南等地重要的养殖品种之一。在斜带石斑鱼人工养殖过程中，细菌、病毒或寄生虫等引起的病害防治和管理工作十分迫切，尤其对于养殖密度较大或者养殖高度集中、更容易造成病害发生和流行的网箱养殖场，渔民们不得不依赖抗生素来进行石斑鱼病害防治，而抗生素的滥用导致了严重的食品安全问题。因此，要从根本上解决石斑鱼等经济鱼类的病害、食品安全问题，需要开发使用优质饵料、合理选用免疫制品、结合科学防病等措施来提高养殖鱼类机体的抗病力；因此，预防为主，进行石斑鱼的生态健康养殖非常必要[1-3]。

本研究拟开发一种复合益生菌饲料添加剂，探讨其对斜带石斑鱼生长及非特异性免疫特性相关指标的影响，为石斑鱼病害防治的益生菌制剂开发利用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及分组

1.1.1 实验材料

实验用斜带石斑鱼由广东省大亚湾水产试验中心提供；实验饲料包括基础饲料（系市售东丸牌石斑鱼配合饲料）、乳化鱼油包裹饲料（由2%饲料量的乳化鱼油包裹基础饲料）和复合菌饲料（复合菌饲料由基础饲料与不同用量的复合益生菌混匀，再以2%饲料用量的乳化鱼油包裹制得）。实验用复合益生菌为：20%光合细菌（Rhodop seudanonas palustris）菌液、2%短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）菌粉和78%嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌液混合组成（按照质量百分比），每10 g复合菌含2.0 ml光合细菌菌液、0.2 g短小芽孢杆菌菌粉和7.8 ml嗜酸乳杆菌菌液。实际操作是，先将短小芽孢杆菌菌粉混合到嗜酸乳杆菌菌液中，再将其与光合细菌菌液混合均匀制得。

实验用益生菌由广东海大集团股份有限公司研究院提供；其中，光合细菌、嗜酸乳杆菌和短小芽孢杆菌的有效活菌数分别为1.0×109、1.0×109cfu/g和2.0×109cfu/g。

1.1.2 实验分组及石斑鱼养殖管理

实验用斜带石斑鱼初始体质量为(64.69±8.65)g，随机分为对照组、乳化鱼油组和复合菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组共5组，每组设3个平行，每个平行10尾鱼，共150尾鱼；对照组投喂基础饲料，乳化鱼油组投喂乳化鱼油包裹饲料，复合益生菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别投喂对应的复合菌饲料，其中复合菌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组饲料分别由每千克基础饲料添加10、30 g和50 g复合菌混合均匀制得。

每日定时定量投喂，投喂率为体重的2%。各复合益生菌饲料组的饲料准备在饲喂前30 min完成；饲喂实验共30 d。

养殖池水体采用沙滤海水，池内为对流式进出水；实验期间保持养殖池的连续充气状态，于广东大亚湾水产试验中心的水泥池网箱中进行养殖。

1.2 指标及测定方法

1.2.1 生长性能指标测定

对饲喂30 d的实验斜带石斑鱼进行称重和测量体长。

体增重率(%)=[(试验末体重-试验初体重)/试验初体重]×100；

体增长率(%)=[(试验末体长-试验初体长)/试验初体长]×100；

饲料系数=投喂量/(试验末体重-试验初体重)；

肥满度（g/cm3）=100×（体重/体长3）。

1.2.2 血清中免疫相关酶活性的测定

于饲喂石斑鱼的第30 d进行血清取样，取样前1 d停止投喂饲料；每组取20尾鱼，采用穿刺尾动脉法取血，采集的血样置于4℃冰箱静置4 h，然后以10 000 r/min离心10 min，收集上层血清测定酶活。血清总超氧化物歧化酶（SOD）、血清总抗氧化酶（TAOC）、血清酸性磷酸酶（ACP）、血清碱性磷酸酶（AKP）和溶菌酶活力测定均按相应试剂盒方法进行（试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，批号均为20130918）。

1.2.3 攻毒实验

对石斑鱼进行称重和体长测量结束后，用哈维氏弧菌活菌菌悬液（1×108cfu/ml）通过腹腔注射进行攻毒，实验组石斑鱼各10尾，0.2 ml/尾，然后置于干净的水族缸内继续饲养并观察10 d，饲养条件和注射前相同，每天多次观察和记录石斑鱼的发病和死亡情况，对死亡的石斑鱼进行解剖、细菌分离并确认死因。按照以下公式计算：

免疫保护率(%)=[1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100。

1.2.4 数据统计

测定结果用“平均值±标准差（X±SD）”表示，统计学处理采用SPSS 17.0软件包进行。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对石斑鱼生长性能的影响(见表1)

由表1可知，与对照组相比，乳化鱼油组的斜带石斑鱼体增重率、体增长率、肥满度和饲料系数均无显著差异（P＞0.05）；与对照组和乳化鱼油组相比，复合益生菌Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组石斑鱼的体增重率与体增长率均显著提高（P＜0.05），肥满度均显著提升（P＜0.05），饲料系数均显著降低（P＜0.05）。由此说明，斜带石斑鱼生长特性显著性差异来源于复合益生菌的作用，也就是说，基础饲料中添加不同剂量的复合益生菌制得的饲料均可以有效改善石斑鱼的生长特性，并提高饲料利用率。值得提出的是，不同复合益生菌用量的Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组间石斑鱼的体增重率、体增长率、肥满度、饲料系数等差异性均不显著（P＞0.05）。

表1 复合益生菌对斜带石斑鱼的促生长作用（X±SD，n=20）

2.2 复合益生菌对石斑鱼血清中免疫相关酶活性的影响(见表2)

由表2可知，与对照组相比，乳化鱼油组石斑鱼血清AKP、ACP、总SOD、T-AOC和溶菌酶活力与对照组无显著差异(P＞0.05)；而复合益生菌Ⅰ组、Ⅱ组石斑鱼的血清AKP、ACP活力均显著升高(P＜0.05)，总SOD、TAOC、溶菌酶活力呈极显著性升高(P＜0.01)；复合益生菌Ⅲ组的ACP活力呈显著性升高(P＜0.05)，AKP、总SOD、T-AOC、溶菌酶活力呈极显著性升高(P＜0.01)。但与乳化鱼油组相比，复合益生菌Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组斜带石斑鱼的血清AKP、ACP、T-AOC、溶菌酶活力均显著升高(P＜0.05)，总SOD活力呈极显著性升高(P＜0.01)。

表2 复合益生菌对斜带石斑鱼免疫相关酶活性的影响（X±SD，n=20，U/ml）

由此说明，添加益生菌可有效提高斜带石斑鱼部分非特异免疫特性的作用，包括增加血清AKP、ACP、T-AOC和溶菌酶活力和增加血清总SOD活力。复合菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间石斑鱼AKP、ACP、总SOD、T-AOC和溶菌酶活力均无显著性差异（P＞0.05）。这说明，基础饲料中添加3种不同剂量的复合益生菌均可增强石斑鱼的非特异性免疫功能，但不同用量组间差异不显著。

2.3 复合益生菌对攻毒后石斑鱼成活的影响（见表3）

表3 复合益生菌对斜带石斑鱼攻毒后的影响（n=10，%）

如表3所示，复合益生菌饲料投喂攻毒后斜带石斑鱼，在复合益生菌Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别较对照组存活率高30.0～40.0个百分点，较乳化鱼油组存活率提高20.0～30.0个百分点；复合益生菌Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别较乳化鱼油组的免疫保护率提高40.0个百分点以上，最高达到60.0个百分点。

由此可见，基础饲料中添加复合益生菌可明显提高对攻毒石斑鱼的免疫保护作用，从而提高了攻毒石斑鱼的存活率。

3 讨论

本研究中，以复合益生菌饲料饲喂斜带石斑鱼30 d，均表现出明显促进了石斑鱼的生长和饲料利用率的提升。就组成复合益生菌的菌种而言，光合细菌、短小芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌均属水产养殖中常用的益生菌，已分别有促进鱼类生长的文献报道[4-7]，但未见将这3种菌一起复配的相关研究。与相关文献报道不同的是，本实验用乳化鱼油将复合益生菌包裹于饲料表面，避免了投喂时菌体快速分散于水中而流失，从而保证了复合菌与饲料颗粒一起能被实验鱼充分有效摄食；乳化鱼油组斜带石斑鱼的各项指标较对照组均未构成统计学上的差异性，由此提示，乳化鱼油包裹可作为益生菌拌料的可行方式。

鱼类在抵抗病害感染时，机体的非特异性免疫会发挥十分重要作用，免疫相关酶的活性会被激活[8-9]。在鱼类等低等脊椎动物及软体动物中，SOD是机体内一种重要的抗氧化酶，AKP作为重要的代谢调控酶，ACP作为溶酶体酶的重要组成部分，它们保证了溶酶体有效完成防御和消化的双重功能，T-AOC在抗氧化调节方面起重要作用,溶菌酶则是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分。若鱼体内上述几种酶活力提升，则机体抗病力显著增强。

本研究表明，饲喂复合益生菌后石斑鱼血清中有5种免疫相关酶的活性均显著升高，可见鱼体免疫功能从多途径方面得以增强，从而保证其健康生长。该复合益生菌体现出的增强免疫功效可能与菌种的选择、菌种量或菌种复配方法等有关。复合菌中的光合细菌菌液中富含自身代谢产生的免疫多糖及辅酶Q10，具有良好免疫刺激活性及抗氧化活性[10]；短小芽孢杆菌能产生高抑制弧菌活性的细菌素，对水产上常见主要致病菌有良好的拮抗效果[5]；嗜酸乳杆菌产酸能力和分泌乳酸菌素的能力强，可黏附于鱼肠道表皮细胞，酸化肠道，刺激肠道免疫和抑制病原菌[7]。这三种菌复配时，光合细菌菌液偏碱性且含有高含量的黏多糖，嗜酸乳杆菌菌液呈酸性，而短小芽孢杆菌具有一定的缓冲能力和酸中和能力，因此，先将嗜酸乳杆菌与短小芽孢杆菌混合，有助于减少pH值的瞬间变化对嗜酸乳杆菌和光合细菌的影响，同时利于增加混合均匀度。

本实验构建的复合益生菌不仅综合了各组成菌的优良特性，同时促进了不同菌之间的互作，如光合细菌的代谢产物能促进嗜酸乳杆菌和短小芽孢杆菌的繁殖，短小芽孢杆菌在石斑鱼体内快速繁殖降低肠道氧化还原电位，为嗜酸乳杆菌的增殖创造良好的厌氧环境。

斜带石斑鱼以哈维氏弧菌攻毒实验结果表明，饲喂复合益生菌的鱼死亡出现时间延后，且死亡率明显低于对照组，这进一步体现了复合益生菌具备良好的增强免疫效果。

最后，三种不同剂量的复合益生菌饲喂斜带石斑鱼后，组间的生长性能指标与免疫特性指标均无统计学意义上的差别，即未呈现明显剂量效应，这可能与实验中选择的剂量水平有关，实验中各菌种的菌数水平较高，分别达到109cfu/g。若基于性价比最优或安全性剂量水平考虑，最适复合益生菌添加水平需要进一步进行研究。