山竹壳色素通过微波辅助结合超滤法分离研究

■周孟清 张 璐贾 峰 宴和平 谢申伍 赵银丽 黄 进

（1河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001；2.广州市正农饲料有限公司，广东广州 511450；3.云南东恒集团生物饲料公司，云南富源 655500）

饲料添加剂指各种用于强化畜禽饲料效果和有利于配合饲料生产和贮存的一类非营养性微量成分，来源于植物的饲料添加剂种类繁多，通过分离提取可以获得无毒的植物活性成分。对动物无毒无害且有明显促生长等有益作用，但还没有获得国家饲料添加剂标准认可的植物提取物可以被称为准饲料添加剂。绿色天然的饲料添加剂级色素在蛋鸡生产中是重要的组成部分，它有利于蛋黄着色，蛋黄颜色是禽蛋感官品质评定的一个重要指标。非绿色天然色素对人体有不同程度的毒性（温广宇等，2003)，甚至会导致生育力下降、畸胎等。

山竹原名为莽吉柿，其果树是藤黄科常绿乔木，原产于东南亚地区，对环境的要求十分严格，与榴莲齐名，号称“果中皇后”。山竹果实含有丰富的山酮素、羟基柠檬酸、微量元素（陈嘉曦等，2007)等成分，羟基柠檬酸（HCA）对抑制脂肪合成、抑制食欲和降低体重有着良好的功效，山酮素则具有止痛抗菌作用（Palakawong等，2013)，抗病毒，抗突变作用，对心血管系统也有很好的保护作用。山竹果皮含有氧杂蒽酮、单宁酸等物质，氧杂蒽酮具有氧化（Moongkarndi等,2014)和抗癌作用（冯建光等，2009)。山竹壳色素是一种醇溶性色素，有较强的抗氧化性、抗热性，具有良好的稳定性（胥秀英等，2006)，其与蔗糖、葡萄糖、苯甲酸钠等常用食品添加剂有非常好的混用性，Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+及柠檬酸、VC 等不影响其稳定性,但Cu2+会加深其颜色，还原剂、紫外光、NaHCO3对色素有减色的作用，Fe3+对其具有破坏作用（章斌等，2011)。山竹壳是良好的天然食用和饲料用色素提取原料，其天然红色素不仅安全，还具有一定的营养价值和药理作用。

山竹壳色素分离提取是开发成饲料添加剂的重要步骤，传统的分离方法具有耗时、耗能、提取率低、化学成分易改变等缺点，而膜分离技术具有无污染、无相变、能耗低、操作简单等优点（洪宜斌等,2003)，已经广泛的应用到各个领域。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜山竹(郑州水果批发市场),无水乙醇（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司），盐酸（分析纯，洛阳昊华化学试剂有限公司）等。电子天平（上海精密科学仪器有限公司），JZ 7114号微型植物粉碎机（上海市嘉定粮油检测仪器厂），101型电热鼓风干燥箱(上海市实验仪器总厂),20-270目筛(上虞市五四仪器筛具),D8023CTL-K4型微波炉（佛山市顺德区美的微波炉电器制造有限公司）,723N-可见分光光度计（上海科技有限公司）、超滤膜（天津森诺过滤技术有限公司）。

1.2 试验设计

采用4因素3水平的正交试验设计，如表1所示。

表1 试验因素及水平

1.3 标准曲线的制作

山竹壳色素经超滤提取后，采用旋转蒸发仪50度蒸发得到浓缩物质作为标准品。配制30%乙醇-0.108%HCl混合液作溶剂，分别称取标准品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g，用上述溶剂溶解标准品并分别转移至5个25 ml容量瓶内，摇匀，静止。以上述溶剂作为参比溶液，在波长为520 nm处测吸光度，重复以上操作，做平行试验，做出标准曲线：y=26.081x+0.005（R2=0.978 1）。

图1 山竹壳色素的标准曲线

1.4 试验步骤及操作

新鲜山竹壳→洗净→放入干燥箱烘干→粉碎→过筛→微波辅助乙醇溶解→粗过滤→滤液进行超滤→可见分光光度计测吸光度→各组分吸光度比较。

烘干：山竹10 kg去肉得山竹壳，50℃烘干10 h,测得水分含量为3%。

粉碎：将山竹壳粗破碎后，放入粉碎机内粉碎，然后用30、100、200目的分级筛筛分，分别收取筛下物，筛上部分继续用粉碎机粉碎，重复以上操作，将所得的所有筛下物分别放入原料袋内保存，并做好标记。

溶剂配制：分别配制30%乙醇-0.108%HCl混合液，40%乙醇-0.108%HCl混合液，50%乙醇-0.108%HCl混合液，密封放置。

溶解：根据1∶10（g/ml）的料液比溶解不同粒度的山竹壳粉末约50 g。

微波处理：用微波炉辅助处理溶有山竹壳原料乙醇溶液，以利于分离提取。

超滤：用超滤装置进行分离，分别针对不同溶剂浓度、粒度、微波处理时间、微波功率进行超滤以确定最佳的提取条件。

测量：用30%乙醇-0.108%HCl混合液提取剂作为参比溶液，将待测液置于520 nm波长下进行吸光度A测定。同样将其它试验组吸光度测定出来，并与标准曲线对照，得出提取率。

1.5 数据处理

应用分析软件SPSS17.0 for Windows对试验数据进行统计分析。不同处理的样品数据显著性差异采用一般线形模型方差分析(ANOVA，LSD检验)进行检验，数据结果以平均值(S)±标准差(SD)表示。

2 结果与分析

2.1 山竹壳色素类物质超滤法分离的正交试验

试验采用4因素3水平的正交试验设计，在料液比为1∶10（g/ml）,所用溶剂为220 ml，山竹壳颗粒质量为50 g，山竹壳颗粒粒度、提取剂乙醇浓度、微波作用时间、微波功率4因素3水平条件下提取效果如表2所示。

表2 山竹壳色素类物质微波辅助结合超滤法分离的正交试验结果

2.2 正交试验的方差分析和回归分析

由主体间效应的检验可得：山竹壳粒度（A）和溶剂浓度(B)是影响山竹壳色素提取率大小的关键性因子(P＜0.05)。且随溶剂浓度增加，山竹壳色素提取率有上升趋势。随着山竹壳粒径减小，山竹壳色素提取率有上升趋势。

由粒度在每个水平间的多重比较可得，30目与100目对吸光值影响差异不显著(P＞0.05)，粒度在30目与200目对吸光值影响差异显著（P＜0.05），100目与200目对吸光值影响差异不显著(P＞0.05)，100目为提取试验时应该注重的因素水平。

由溶剂浓度在每个水平间的多重比较可得，溶剂浓度水平中1与2比较差异不显著(P＞0.05)，水平1与3比较差异显著(P＜0.05)，水平2与3比较对吸光值的影响差异显著(P＜0.05)，则水平2和3为提取试验时应注重的因素水平。

因此，对山竹壳色素提取分离时，粒度和溶剂浓度对试验结果的影响为主要因素，为试验应该严格控制的因素。

回归分析得到模型：y=-2.619+0.36X1+0.482X2-0.16X3-0.184X4,(P＜0.05)

当微波功率为160 W，作用时间为20 s时，方程变为：y=-31.899+0.36X1+0.482X2，所做响应面图见图2。

根据正交试验结果回归方程可知：A取A2、B取B2、C取C1、D取D2时山竹壳色素提取率达最高，即在本试验中山竹壳色素分离的最好条件为：A2B2C1D2，所以用A2B2C1D2组合进行验证试验，试验流程同上，最终得到的吸光度为1.121，小于6号处理组。而6号处理组A2B3C1D2的吸光度为1.316，是10个处理组合中吸光度最大的。即山竹外壳红色素提取率最高的。所以，最优处理组合为A2B3C1D2，即山竹壳粉末颗粒大小为过100目筛、提取溶剂为50%乙醇-0.108%HCl混合溶液、微波溶解功率为160 W、微波溶解时间为20 s。

3 讨论

3.1 原料粒度对提取效果的影响

适宜的原料粒度有利于其中活性物质的提取(马雪松等，2006)，适宜的粒度不但增加了溶剂与原料的接触面积，也减少了不必要的电力等能源的消耗。Chupin等(2015)研究了微波辅助法提取海岸松树皮中活性物，发现在5种不同原料粒度下，提取得到的产物有差异。Krogell等(2013)研究了云杉皮木材中半纤维素的提取，0.5～12.5 mm不同粒径木材颗粒对提取结果有强化作用，颗粒越小半纤维素得率越高。本试验中原料的粒度分别为30目，100目，200目，不同的粒度对分离结果的影响差异显著，结合粉碎耗能考虑，为了节约电力能源，粒度可以选择100目大小。

3.2 溶剂浓度对提取效果的影响

溶剂浓度对提取效果的影响是一个重要因素，有些作者研究发现使用0.108%HCl-95%乙醇作为提取剂，提取山竹壳红色素效果较好（胥秀英等，2006），李宇伟等(2012)研究金银花中绿原酸的提取分离，发现乙醇用量为75%，时提取率较高，马雪松等(2006)研究分离黄芪中甲苷，溶剂浓度60%效果最佳，溶剂浓度对试验结果有显著影响。本试验中使用超滤装置，结合方差分析和实际情况，溶剂浓度选在50%，溶剂浓度对分离结果影响显著（P＜0.05）。

试验过程中，已经过滤好的山竹外壳红色素溶液碰到蒸馏水时会产生一种乳白色的液体，其成分和结构需要后续试验进行深入研究。

山竹壳色素具有一定的药理及营养价值，其不仅对心血管系统有保护作用，且具备抗肿瘤、抗菌及抗氧化性等特性，可以说是一种安全可靠的天然食用色素，可以投入开发成食品和饲料添加剂。

3.3 超滤对提取效果的影响

本试验中超滤对提取效果的影响没有对照组，没有直接数据说明其作用。而从膜过滤的特征来看，纳滤、反渗透、超滤膜过滤具设备规模小、能耗低、分离效率高的特点。膜分离技术具有一系列优点：膜分离过程的能耗比较低、适合热敏性物质分离、分离装置简单、操作方便、工艺适应性强、便于回收、没有二次污染。也有研究者采用分子印记法（Piacham等，2015)、超临界CO2法（Mishima等，2013)分离山竹中活性物质，

4 结论

本试验采用4因素3水平正交设计，分别对山竹壳颗粒大小、溶剂浓度、微波溶解时间和微波溶解功率进行研究，发现在料液比为1∶10的弱酸条件下，用过100目筛的山竹壳粉末、溶剂浓度为50%乙醇-0.108%HCl溶液、微波功率为160 W、微波溶解时间为20 s时，采用超滤结合微波辅助方法提取山竹壳红色素，提取率为22.1%。本试验的创新点在于采用了微波辅助与超滤膜分离相结合的方法，分离得到浓缩的山竹红色素溶液，为未来人们将山竹壳红色素开发成食品和饲料添加剂提供了一定的借鉴意义。