响应面法优化砂引草多糖的提取工艺

■张 欣 贝盏临 丁春霞

(1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021；2.沾化县第一中学,山东滨州 256800)

砂引草（Messerschmidia Sibirica Linn.）系紫草科（Boraginaceae）紫丹属（Tournefortia）植物，又名紫丹草、西伯利亚紫丹。砂引草为多年生宿根中旱生草本，一般4月初萌芽进行营养生长，5～6月开始开花，6～7月结实，种子8月下旬成熟，果后仍有一段营养期，9～10月逐渐干枯。根状茎细长，斜生或匍匐，多水平分布于土表下15～20 cm处，伸展可达1～2 m，垂直根最长可达到1 m左右深处。主要分布于中国大陆及周边北纬30°～45°相毗邻的国家，对海拔和环境周边要求比较低，海滨砂地、干旱荒漠、山坡道旁均有生长。砂引草属中旱生植物，在近人栖地和草场植被中的杂草，在我国广泛分布北方从草原到荒漠、从半湿润到干旱地区，可生长于天然的固定、半固定的沙丘上，以及人工固定后的较平缓的沙丘上[1]，目前尚未由人工引种栽培。通常砂引草只是作为食草动物越冬所采食的牧草，据报道砂引草营养生长期有较高含量的粗脂肪和粗蛋白质，其中粗蛋白质种类、品质还可与紫花苜蓿媲美，有9种人体必需氨基酸的含量高于麦麸和谷类饲料及一般的禾本科牧草，此外砂引草花朵中含有芳香油的分泌细胞，香味独特、浓郁悠长。对于砂引草的研究近年来主要集中于其泌盐结构及对盐渍沙质土壤改良等生态学特性的研究[2-3]，而对其多糖成分研究鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

砂引草（宁夏）、酒精（AR）、苯酚（AR）、浓硫酸（AR）、纯水（15 MΩ.cm）、葡萄糖（标准品）。

1.1.2 实验器材（见表1）

表1 试验器材型号及生产厂家

图1 温度对提取率的影响

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

用UV765紫外-可见分光光度计在390～780 nm范围内进行波谱扫描，检测最大吸收峰波长为480 nm。以葡萄糖（标准品）测定的线性回归方程是：C=162.6A-9.717，相关系数R2=0.997 9。

1.2.2 多糖含量与提取率的测定

采用苯酚-硫酸法[4]，精密吸取样品溶液1.0 ml加纯水稀释定容至25.0 ml，从中精密吸取1.0 ml，置于10.0 ml容量瓶中，加纯水2.0 ml、5%的苯酚溶液1.0 ml，摇匀，加入浓硫酸5.0 ml，摇匀后置于40℃水浴15 min，冷却10 min后在波长480 nm处测定吸光度[5]，以纯水做空白。多糖提取率计算公式：多糖提取率（%）=[比色液浓度（μg/ml）×比色液体积（ml）×定容体积（250.0 ml）]/[供试样品体积（0.5 ml）×实验样品质量（g）×106]×100。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

溶剂提取法采用水提-醇沉法[6]。选定料液比、浸提温度、浸提时间3个实验因素进行试验。先用90%的乙醇回流1.0 h，然后用蒸馏水提取多糖，选定温度、时间、料液比3个影响因素，研究糖提取率的影响。

2.1.1 温度对多糖提取率的影响

称取等量砂引草5 g，分别置于8个150 ml的圆底烧瓶中，温度梯度分别为30、40、50、60、70、80、90、100℃，将定容于80 ml的90%乙醇于80℃下回流1 h，提取1次，恒温水浴分别为30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，料液比为1∶20，水浸提时间1.0 h。浸提温度对砂引草多糖提取率的影响，结果见图1。

由图1可知，随着提取温度的升高，多糖提取率不断增大，在70℃前增加较为显著，以后增加不太明显，温度在70、80、90℃的提取率曲线较为平缓，同时从提取的多糖溶液可以看出，随着温度的升高，多糖颜色加深。超过100℃多糖容易分解产生单糖而溶解在浓乙醇中影响多糖的提取率，因此选择70～90℃作为提取的较适宜温度，从曲线中可以看出在70℃时提取率达到了一个顶峰为2.40%。

2.1.2 料液比对多糖提取率的影响

将定容于80 ml的90%乙醇于80℃回流1 h，提取1次，固定水浸提温度为80℃，料液比分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，水浸提时间1 h。结果见图2。

图2 不同料液比对提取率的影响

由图2可知，随着加水量的逐渐增大，多糖提取率几乎呈直线上升。由于提取水量的增加，则提取的多糖溶解在水中的量就越多，从而损失的多糖量就越少，相应多糖提取率就高，但增大到一定程度后，多糖提取率几乎不变，再增加水量多糖的提取率反而降低，因此选择料液比在1∶30左右提取率较高达到了一个顶峰为2.38%。

2.1.3 浸提时间对多糖提取率的影响

将定容于80 ml的90%乙醇于80℃回流1 h，提取1次。固定水浸提温度为80℃，料液比1∶20，提取时间分别为1、2、3、4、5 h。结果见图3。

图3 时间对提取率的影响

由图3可知，随着加热时间的增加，多糖提取率在2 h前增加显著，以后增加较为平缓，增大到一定时间以后多糖提取率几乎保持不变。可能由于加热时间过长，促进多糖的溶解使得提取率增大，但是加热时间过长提取率无明显变化，考虑到经济效益，提取时间选择2～3 h为宜，3 h达到提取的达到了一个顶峰为2.44%。

2.1.4 响应面分析法优化砂引草多糖提取工艺的研究

砂引草→乙醇热回流→蒸馏水回流→滤液定容于250 ml容量瓶中→滤液定容25 ml容量瓶中稀释→取出1 ml滤液与10 ml容量瓶中→加入苯酚、浓硫酸、蒸馏水→热水中加热15 min冷却10 min→测OD值。采用Design-Expert软件完成本实验的响应面分析[7]。在完成单因素实验后，使用软件Design-Expert，选择Response surface中的Box-Benhnken[8]，可以得到温度时间等高线，温度料液比等高线和3D曲线图，由RSM预测最优值，按照要求填入相应参数后预测最优值，得出实验结果，选出最优提取条件。

2.2 讨论

对提取温度（T）、提取时间（t）、料液比（1∶Z）作如下变换X1=(T-70)/30，X2=(t-3)/2，X3=(Z-30)/10，以3次实验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y)，实验设计与实验结果见表2～表3。其中2、3、6、7、8实验室用来估计实验误差，其他的为析因实验。采用De⁃sign-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken Design(BBD)设计见表3，响应面分析处理结果见图4～图6。

表2 响应面实验因素水平

表3 响应面实验设计及数据处理

图4 Z=f(X1，X3)的响应面与等值线

图5 Z=f(X1，X2)的响应面与等值线

图6 Z=f(X2，X3)的响应面与等值线

通过软件Design-Expert 8.0.6分析，当提取温度(T)为40 ℃、提取时间(t)为5 h、料液比(1∶Z)为1∶40 mg/ml，砂引草的多糖提取率Y为最大值2.77%。

3 结论

通过单因素实验以及3因素3水平的响应面法实验，建立了提取率与各影响因素之间的数学模型，依此数学模型可以预测理论提取率，并确定砂引草多糖的最佳提取工艺参数：浸提温度40℃、浸提时间5 h、料液比1∶40，在此工艺条件下提取砂引草多糖提取率较高可达2.77%。

响应面分析法分析砂引草多糖理论提取最高值为2.77%，依据此模型提取工艺砂引草实际实验提取率为2.75%，比理论值提取率要低0.02%。因为在实验控制不可能达到如此精密，此外提取时间、料液比也会出现人为误差，为了调整实验因素的可操作性和便利性，将时间温度和料液比修正为整数，所以出现了理论值的提取率偏差问题。但是提取率偏差不大，可操作性强实用好，能更好的为应用到往后的科研实践中。在单因素的情况下，温度的最高提取率为2.36%，料液比的最高提取率为2.34%，时间的最高提取率为2.42%。没有一个单因素的提取率高过理论值，说明响应面分析的最优值真实可靠。因此，利用响应面分析法对砂引草多糖浸提条件的优化是可行的，得到的砂引草多糖提取条件真实可靠，具有实用价值。