载脂蛋白A-I模拟物的功能

刘源 张崧 叶平⋆

载脂蛋白A-I模拟物的功能

刘源 张崧 叶平⋆

近年，载脂蛋白A-I模拟物疗法这一相对较新的领域取得许多重要进展，支持其不仅有治疗心血管疾病的强大潜力，同时涉及慢性炎症和氧化以及其他疾病状态的治疗。正在开发中的各种载脂蛋白A-I模拟肽均显示出强有力的心脏保护功能，可媲美甚至超越全长载脂蛋白A-I（apoA-I）和高密度脂蛋白（HDL），本文旨在探讨这些肽分别负责哪些不同的功能，同时确定其结构特征和运行机制。

1 胆固醇流出功能

迄今为止，HDL最主要被研究的功能是促进胆固醇逆向转运（RCT）的能力。探讨载脂蛋白A-I模拟肽促进RCT的研究主要是针对单螺旋肽和双螺旋肽，其中的一些肽在促进CE的过程中表现出可以与全长apoA-I相似甚至超越的能力。如双螺旋模拟肽5A在脂质贫乏时可以通过介导ABCA1促进胆固醇流出，而非ABCG1，而且5A与合成的磷脂棕榈酰油酰磷脂酰胆碱（POPC）联合应用会增加3倍的胆固醇流出，这一过程主要是通过增强非特异性水溶液扩散的作用。在易发生动脉粥样硬化的apoE基因缺陷小鼠静脉给予5A/POPC，循环高密度脂蛋白通过增加ABCA1和ABCG1的水平使得磷脂和胆固醇流出增加［1］。该研究还通过追踪放射性胆固醇从巨噬细胞到粪便的运动，发现5A/POPC输液增加了全身的RCT。另有研究关注一种被称为ETC-642的多肽/脂质复合物，它是由单螺旋肽ESP 24218，鞘磷脂，和1，2 -二棕榈酰-sn-甘油基-3 -磷酸胆碱（DPPC）以质量比1：3.75：3.75合成的。ETC-642对胆固醇流出人类巨噬细胞这一过程表现出剂量依赖性的影响，这与脂化全长载脂蛋白A-I（apoA-I/ POPC）的效果相似。

为明确双螺旋肽对高密度脂蛋白功能的影响，其各种结构特征已被探测。许多的特征对胆固醇流出的效率和特异性有显著的影响，包括疏水性，疏水面的大小，电荷和多肽连接桥的灵活性等，最终确定-0.5的平均疏水性值是最理想的，而增加疏水面的尺寸、维持电中性和桥的灵活性都对胆固醇流出有益。利用这一研究结果，一个“理想的”肽ELK-2A2K2E被设计出来，它被证明有很高的促进胆固醇流出的能力，明显比全长载脂蛋白A-I更有效。

除了提高合成肽在一个特定的功能，如胆固醇流出中的作用更有效，研究者还努力增加它们的生物稳定性和可用性。载脂蛋白A-I模拟肽的螺旋结构被一种称为烃缝合的技术而稳定化合成，即在两圈螺旋结构之间引入共价键。这种连接是针对螺旋的特殊位点，防止其解旋，稳定其对抗高温和蛋白酶变性。此修改不仅可以增加一个给定肽的胆固醇流出能力，也代表可以减少肠道蛋白水解的潜在手段，从而增加口服肽的生物利用度。应用于几个现有模拟肽的另一种方法是以D型的氨基酸合成的，而不是天然存在的L型异构体。这种合成方式能让其抵御肠道蛋白水解酶的作用，同时保留了生物物理特性以及大多数生物功效［2］。

2 抗炎功能

如前所述，高密度脂蛋白可以通过各种机制抑制炎症过程，目前模拟肽被证明能复制这些活动，如ETC-642。在体外，ETC-642处理人颈动脉内皮细胞（HCAECs）可以降低由TNF-α刺激的THP-1单核细胞的粘附和减少VCAM-1、MCP-1和NK-κB的mRNA表达。在体内，研究者利用新西兰白兔制成一个增加ICAM-1和VCAM-1表达的血管炎症模型，以前的研究表明，载脂蛋白A-I和HDL都可以在这个模型中降低细胞粘附分子的表达［3］，而静脉注射30mg/kg ETC-642同样可以逆转两个粘附分子的增加。

研究表明，单螺旋肽4F可以影响发展为疾病状态的炎症心血管疾病所导致的炎症。在一个小规模的临床研究中，感染了艾滋病病毒并接受抗逆转录病毒联合疗法的患者被发现有较高的HDL炎症指数（HII），表明这些患者的HDL在调节炎症方面的缺陷。然而，随着4F治疗这些患者的HDL的抗炎活性恢复［4］。在大鼠慢性肾脏疾病（CKD）模型中，4F的皮下给药减少血管脂质沉积和由5/6肾切除术导致的炎症。这些报道支持载脂蛋白A-I模拟肽具有广泛的抗炎功能，推动进一步研究其用于治疗非心血管疾病相关的炎症性疾病的潜在用途。

载脂蛋白A-I模拟肽可以影响抗炎活性的结构特征也被探究。双螺旋肽两个螺旋之间的不对称性被认为是其抑制单核细胞表达CD11b最重要的因素，例如将对称的肽ELK的第二螺旋改变，使得它不再与第一螺旋相同，该肽抑制CD11b表达的能力会有所增加。此外，维持中性或阴性的净电荷以及＜180°的疏水面也对抗炎能力有好处。也有研究发现，可以影响抗炎症反应的结构特征在不同细胞类型中发挥的作用是不同的，与CD11b在巨噬细胞表达相比，VCAM-1在内皮细胞的表达受多肽螺旋不对称性的影响很轻微，而增加疏水性表面的大小以及净正电荷的肽被发现是有利的。这一观察结果显示了人工精心设计的模拟肽在对炎症的选择性干预方面有巨大的潜力。

3 抗氧化功能

氧化的低密度脂蛋白（oxLDLs）是血管壁发生炎症和动脉粥样硬化的一个强效的触发器。载脂蛋白A-I模拟物与健康人的高密度脂蛋白和载脂蛋白A-I一样可以通过多种机制抑制或阻止低密度脂蛋白脂质和蛋白质的氧化修饰，包括（1）作为活性氧和氧化脂质的直接清除剂。（2）抑制氧化启动物质如12 -脂氧合酶的作用。（3）抑制与高密度脂蛋白活动相关的酶如PON1和PAF-AH的活性。前文关于载脂蛋白A-I模拟肽的抗炎特性所讨论的大鼠慢性肾病模型，对载脂蛋白A-I模拟物的抗氧化功能也进行了观察。在此模型中，肾功能减退导致系统性氧化应激的增加，用4F处理后主动脉壁中蛋白质的氧化产物（硝基酪氨酸）的数量会降低，血浆和尿中的脂质氧化产物（丙二醛）的浓度也降低。4F还通过影响抗氧化酶减少氧化应激。锰超氧化物歧化酶（MnSOD）是一种催化超氧负离子生成水和过氧化氢的抗氧化剂酶，在卵巢癌细胞株，4F治疗增加MnSOD的表达水平和活性［5］。

对于影响载脂蛋白A-I模拟肽抗氧化能力的结构特征，研究证实包含半胱氨酸或组氨酸的双螺旋模拟肽ELK和5A会增加其抑制LDL脂质氧化的能力。其他一些结构变化如利用一个丙氨酸残基取代脯氨酸从而改变肽连接键的灵活性，或转换到G型或Y型螺旋都会增加其抗氧化的能力。

4 新兴领域

炎症和氧化是除了心血管疾病之外许多疾病的共同特点，因此，载脂蛋白A-I模拟肽的抗炎和抗氧化作用可能在其他与炎症和氧化应激相关的疾病状态也很有用。目前的研究主要包括以下几个方面。

4.1 抗肿瘤功能 已有研究表明载脂蛋白A-I及其模拟肽对小鼠卵巢癌模型中抑制肿瘤的发展能产生有利影响，其中首先发现的是，当被注入了上皮性卵巢腺癌细胞系（ID8细胞）后，载脂蛋白A-I转基因小鼠比野生型小鼠的生存时间更长，抑制了肿瘤发展。随后对载脂蛋白A-I模拟肽的研究发现，在体外，用4F和5F处理ID8细胞导致细胞活力和增殖减少，在体内，皮下注射4F能降低肿瘤质量和体积，这种效果可能是由于载脂蛋白A-I模拟物治疗的动物增加了溶血磷脂酸（LPA），一种已知可促进肿瘤发生的溶血磷脂，与高密度脂蛋白结合的结果［6］。如前所述4F能诱导卵巢癌细胞抗氧化酶MnSOD表达和活性升高，也有助于4F发挥抗肿瘤效果。5F肽可以通过另外的机制，如抑制血管生成，以防止肿瘤的发展。

4.2 抗哮喘功能 哮喘是一种慢性疾病，特点是气喘、咳嗽、呼吸急促，是由于肺部气道的过度炎症反应所致。因为载脂蛋白A-I模拟肽已知的抗炎的特性，研究人员推测，其可以作为一种治疗哮喘的有效方法。利用5A肽治疗由尘螨诱发的小鼠哮喘模型可以阻碍哮喘相关的特征，包括气道高反应性及气道重塑的发展［7］。5A治疗还减少了支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量，可能是减少了细胞因子和趋化因子表达的结果。

4.3 对脓毒症的作用 由脂多糖（LPS）诱导的大鼠脓毒症模型会导致低血压，主要是通过激活核因子-κB信号后增加了一氧化氮生成酶NOS2表达的结果。在此模型注射4F后会促进LPS被HDL有效的中和，改善血管的收缩［8］。HDL螯合LPS的能力既往已知，但4F肽似乎可以明显增强这种效果。表面等离子体共振技术已经证明，4F对促炎氧化脂类的结合力比载脂蛋白A-I高4～6个数量级，这很可能是该肽能发挥强效抗炎特性的一个主要因素。

4.4 对SLE的作用 4F肽也可以在自身免疫疾病系统性红斑狼疮（SLE）中发挥作用。在系统性红斑狼疮与加速动脉粥样硬化的小鼠模型中，4F能减少自身抗体产生，减轻骨质稀少和肾小球肾炎等与SLE导致的症状［9］。这些有益的效果很大程度上是由于apoA-I/HDL/模拟肽公认的保护机制，包括抑制VCAM-1和隔离氧化磷脂。应用4F治疗后的模型小鼠主动脉损伤面积增加，但会增加更多的平滑肌区域，降低巨噬细胞区域，形成一个更稳定的组分分布。

5 对心血管疾病的影响

上述的各项研究表明，高密度脂蛋白许多的心脏保护作用，可以被显著的特异性使用模拟肽所概括。此外，载脂蛋白A-I模拟肽治疗至今还未出现较大的毒性问题。因此，许多研究人员现在已经开始在动脉粥样硬化的各种动物模型和临床研究中，将模拟肽这些能力与心血管结果及心血管健康的直接测量指标相关联。在高脂血症家兔模型，注射ETC-642后使用血管内超声（IVUS）评估，发现其可以减轻主动脉斑块负担，这种效应可能与减少促炎性带负电荷的LDL的治疗相关。对载脂蛋白E基因敲除小鼠的模拟肽注射5A磷脂复合物后，主动脉斑块面积减少达53%，机制可能是增加了胆固醇流出。

4F肽也已被证明对糖尿病小鼠具有抗动脉粥样硬化的能力。ApoE基因敲除小鼠给予链脲佐菌素诱发高血糖后，与不给予链脲佐菌素的apoE基因敲除小鼠相比，增加了＞3倍的动脉粥样硬化病变面积。但是，这种动脉粥样硬化面积的增加可以在4F治疗后减少近50%［10］。4F还被证明可以增加胰岛素敏感性，并防止糖尿病心肌病的发生。

为比较载脂蛋白A-I模拟物口服和皮下注射这两种给药方式的疗效是否有区别，接受西方饮食的apoE基因敲除小鼠被利用而研究。通过不同方式使用的相同剂量4F都会降低血浆中急性期蛋白血清淀粉样蛋白A（SAA）的水平，改善HDL炎症指数，并抑制大约50%的主动脉粥样硬化。虽然皮下给药会使4F血浆水平增加很明显，但通过任意一种方法使用4F对于心血管压力的测量数值的效果相似。这些数据表明，模拟肽的效力是由给定的剂量所决定的，而非给药方式或血浆浓度。此外，两种给药方式在粪便中肽的量是相同的，可能预示4F肽在胃肠道中起重要作用。

1 Amar MJ, D’Souza W,Turner S, etal. 5A apolipoprotein mimetic peptide promotes cholesterol efflux and reduces atherosclerosis in mice. J Pharmacol Exp Ther, 2010, 334(2):634～641.

2 Navab M, Anantharamaiah G M, Hama S, et al. Oral administration of an Apo AI mimetic peptide synthesized from D-amino acids dramatically reduces atherosclerosis in mice independent of plasma cholesterol.Circulation, 2002, 105(3): 290～292.

3 Nicholls SJ, Dusting GJ, Cutri B, et al. Reconstituted high-density lipoproteins inhibit the acute pro-oxidant and proinflammatory vascular changes induced by a periarterial collar in normocholesterolemic rabbits. Circulation, 2005,111:1543～1550.

4 Kelesidis T, Yang OO, Currier JS, et al. HIV-1 infected patients with suppressed plasma viremia on treatment have pro-inflammatory HDL. Lipids Health Dis, 2011, 10:35.

5 Ganapathy E, Su F, Meriwether D, et al. D-4F, an apoA-I mimetic peptide, inhibits proliferation and tumorigenicity of epithelial ovarian cancer cells by upregulating the antioxidant enzyme MnSOD. Int J Cancer, 2012, 130:1071～1081.

6 Su F, Kozak KR, Imaizumi S, et al. Apolipoprotein A-I (apoA-I) and apoA-I&mimetic peptides inhibit tumor development in a mouse model of ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107:19997～20002.

7 Yao X, Dai C, Fredriksson K, et al. 5A, an apolipoprotein A-I mimetic peptide,attenuates the induction of house dust mite-induced asthma. J Immunol, 2011,186:576～583.

8 Dai L, Datta G, Zhang Z, et al. The apolipoprotein A-I mimetic peptide 4F prevents defects in vascular function in endotoxemic rats. J Lipid Res, 2010, 51:2695～2705.

9 Woo JM, Lin Z, Navab M, et al. Treatment with apolipoprotein A-1 mimetic peptide reduces lupus-like manifestations in a murine lupus model of accelerated atherosclerosis. Arthritis Res Ther, 2010, 12:R93.

10 Morgantini C, Imaizumi S, Grijalva V, et al. Apolipoprotein A-I mimetic peptides prevent atherosclerosis development and reduce plaque inflammation in a murine model of diabetes. Diabetes, 2010, 59:3223～3228.

国家973项目（2013CB530804）

100039 北京解放军总医院心血管内科 （刘源 叶平）天津医科大学总医院保健医疗部 （张崧）

*通讯作者