枣树全基因组MITEs成分分析与系统进化研究

李勇慧， 冯爱青， 押辉远， 程彦伟， 逯海朋

(洛阳师范学院 生命科学学院 河南 洛阳 471022)

枣树全基因组MITEs成分分析与系统进化研究

李勇慧， 冯爱青， 押辉远， 程彦伟， 逯海朋

(洛阳师范学院 生命科学学院 河南 洛阳 471022)

微型反向重复转座基因(minialure inverted repeat transposable elements, MITEs)的演化可能是造成枣树基因组及品种多样性的重要原因.为研究MITEs在枣树全基因组中的分布、种类及演化，使用MITE预测软件(MITE-Digger)识别枣树全基因组中的MITEs序列，在植物MITEs数据库中进行分类注释，并用MEGA 6.0构建枣树基因组中MITEs的系统进化树.结果显示，MITE-Digger检测出MITEs 总共3 230条，碱基数为1 104 679 bp，占基因组比例为0.34%；其中共有948条在植物MITEs数据库中比对到相似序列，这些MITEs可以归类到5个家族：hAT,PIF/Harbinger,CACTA,Mutator和Tc1/Mariner,MITEs系统进化树显示：枣树基因组中MITEs来源于少数几个共同祖先，在长期的进化中有明显的扩增和突变，这可能与枣树品种多样性有关.研究结果将为枣树的遗传资源及育种研究提供重要参考.

MITEs； 枣树基因组； 系统进化； IMP分子标记技术

0 引言

转座因子(transposable element)是一类可移动的DNA片段，在真核生物的基因组中分布非常广泛.研究显示转座因子的活性在功能、结构及进化等方面对生物基因组有一定的影响，也是形成物种多样性的主要原因之一[1-2].依据转座机理的不同，把转座因子分为两种类型：Ⅰ型转座元件，也称反转录转座子(retrotransposon)，Ⅱ型转座元件，也叫DNA转座子(DNA transposon).按转座活性的有无来划分，DNA转座子又分为自主型转座子、非自主型转座子和微型颠倒重复序列(MITEs).MITEs长度一般为100～800 bp，比较短，包括末端倒转重复(terminal inverted repeats，TIRs)及靶位点的重复序列(target site duplication，TSD)，不能编码转座酶.MITEs与反转座子类似的地方是拷贝数较高，研究发现它们和植物中很多基因相连，主要是由于它们有很强的插入低拷贝区域的偏好，能够插入和跳出基因的某一片段[3].大部分的MITEs很可能来源于不同的DNA转座子亚家族Tc1/mariner，PIF/IS5，CACATA，hAT或Mutator.通过对水稻基因组测序进行分析显示[4-5]，MITEs主要分布于常染色质区，能够形成巢式结构，与反转录转座子不同.研究表明[6]，大多数MITEs都存在于靠近基因附近的非编码区.转座子进行转座会对基因组的大小、结构排列以及染色质的组成成分产生一定的影响，从而进一步影响到基因组的结构、功能及进化.

枣树(ZizyphusjujubeMill.)果实是中国北方的主要水果之一.目前，有数百个枣树品种，不同地区果实形状、果肉味道和肉质会有所不同，这可能与枣树基因组的多样性有关.枣树的这种多样性可能与枣树基因组内的转座子有关.MITEs是一类与基因组进化密切相关的转座子，MITEs分子标记技术IMP(inter-MITE polymorphisms)在许多植物中都已经成功应用.最近几年有人开发了检测MITEs的新软件：MITE-Digger[6]，对分析从头合成比较有效，尤其对基因组比较大的序列更有效.而且MITE-Digger分析的正确率高，错误率低，且分析速度比较快，在Windows系统下就可以使用，所以本文采用MITE-Digger这个软件来分析枣树的基因组.鉴于目前枣树基因组测序刚刚完成，MITEs在枣树全基因组中的分布、种类、所占比例、枣树基因组MITEs演化的研究还没有报道，本研究试图通过分析枣树基因组中MITEs转座子来研究枣树基因组多样性的原因，为枣树多样性研究和遗传资源鉴别提供有力工具.

1 数据来源

枣树的全基因组有12条染色体，从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载枣树的全基因组(12条染色体，序列的NCBI号分别为CM003114.1，CM003115，CM003116.1，CM003117.1，CM003118.1，CM003119.1，CM003120.1，CM003121.1，CM003122.1，CM003123.1，CM003124.1，CM003125.1)，序列保存为FASTA格式.

2 生物信息学方法

2.1 基于MITE-Digger鉴定枣树的全基因组MITEs

利用MITE-Digger软件分析枣树的全基因组.MITE-Digger在分析枣树基因组序列时识别枣树基因组中MITEs的运行参数：MITE全长100～800 bp(也就是大于100 bp小于800 bp的碱基序列鉴定为MITEs)；TSD碱基数范围为>2；侧翼序列不同碱基数的阈值为5 bp[7].

2.2 MITEs的注释及分类BLAST

植物MITEs数据库(plant MITE database,P-MITE)在对基因和基因组序列的注释有很大的帮助和益处，它经常被用于研究MITEs的起源和扩增[8].我们通过P-MITE的BLAST(http://pmite.hzau.edu.cn/MITEblast/blast.htm)功能来注释所得MITEs的归类，从而找到相应的MITEs所对应的家族.

2.3 MEGA 6.0软件构建系统发育树

将能够注释的MITEs序列以FASTA格式输入MEGA 6.0,以最大简约法构建系统发育树，使用软件默认参数.

3 结果与分析

3.1 枣树MITEs的分布

MITE-Digger检测出枣树基因组中的MITEs总共3 230条，总碱基数为1 104 679 bp，占全基因组的比例为0.34%.共有948条在植物MITEs数据库(P-MITE)中比对到相似序列，碱基数为323 856 bp，平均每339 201.0 bp出现一个注释的MITE，占基因组比例为0.10%.各条染色体检测出的MITE条数及占各染色体的比例如表1.

从表1中可以看出第4条染色体检测出来的MITEs是最少的；第1条染色体检测出来的MITEs是最多的；其他的几条染色体检测出来的MITEs相差不太大.平均每99 555.0 bp出现一个MITE，每个MITE的平均长度为342.0 bp.还可以看出，每条染色体检测出来的MITEs所占各自染色体的比例都很小，与水稻相比还是有一定差别的[9].

3.2 枣基因组MITEs的注释及分类

通过序列比对，共有948条在P-MITE中找到相似序列，碱基数为323 856 bp，占基因组比例为0.10%.发现这些MITEs来源于5个DNA转座子家族：hAT,PIF/Harbinger,CACTA,Mutator和Tc1/Mariner；还有一部分MITE没有和任何DNA转座子家族匹配上，这些MITE可能是枣基因组特有的.这5个家族的分布见表2.结果显示主要分布在PIF，Mutator，hAT家族.

3.3 枣基因组中MITEs系统发育

MITE-Digger检测出确认的MITEs 总共3 230条，其中共有948条在P-MITE中比对到相似序列，对注释上的MITEs利用MEGA 6.0构建枣树基因组MITEs的系统发育树，如图1所示.从图中可以看出，此进化树分为4个类群Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ.其中第Ⅰ类群和ZRSiTEMT05900030(来源于玉米基因组中的一个MITE序列)在一个分枝上，类群Ⅱ和ORSgTEMT00100126(来源于水稻基因组中的一个MITE序列)，ORSgTEMT01601525(来源于水稻基因组中的一个MITE序列)，ZRSiTEMTOOT00002(来源于玉米基因组中的一个MITE序列)在一个分枝上，类群Ⅲ和ORSgTEMT00502514(来源于水稻基因组中的一个MITE序列)，ZRSiTEMT05600001(来源于玉米基因组中的一个MITE序列)在一个分枝上，证明它们和相应的水稻、玉米基因组内的MITEs具有一定的亲缘关系，可能来源于一个共同的祖先.而类群Ⅳ没有水稻、玉米基因组MITEs，说明是枣树特有的类群.

从图1还可以得出，这4个分支源于少数几个共同的祖先，经过长期进化中，祖先的基础上有明显的扩增和突变，说明枣树基因组MITEs的活动处于不稳定状态.分支Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ上各自的亲缘关系都很近，这说明这3个分支上的MITEs在发育过程中进行了一系列的扩增，从而引起了枣树基因组的多态性.在这3个分支中，分支Ⅱ上MITEs最多.

4 讨论

由表1知枣树中的MITEs 总共3 230条，总碱基数为1 104 679 bp，占基因组比例为0.34%，其中有948条在P-MITE中比对到相似序列，碱基数为323 856 bp，占基因组比例为0.10%.无论是检测出来的总的MITEs，还是匹配上的MITEs,在枣树基因组中所占的比例都很小.6种植物中MITEs所占的比例如表3所示[10].从表3中可以看出水稻中的MITEs所占的比例是最大的，高粱中的MITEs所占的比例是最小的，枣树基因组中的MITEs所占的比例相对这几种植物来说还不算太低，而且枣树中MITEs的全长为323 856 bp，平均长度为341.26 bp，仅次于高粱，所以应用MITEs转座子来研究枣树的基因组多样性是比较可行的.

由图1枣树基因组MITEs的系统发育树知，分支Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ上各自的亲缘关系都很近，这说明这3个分支上的MITEs在发育过程中进行了一系列的扩增，从而引起了枣树基因组的多态性.因此可以利用这3个分支上的MITEs的保守序列分别设计引物，来进一步扩增枣树基因组内的MITEs，以研究枣树基因组的结构和功能.同时还可以根据枣树基因组内MITEs的相对稳定性来开发枣树体内的MITEs的分子标记，以期研究枣树基因组内的MITEs所引起的基因多态性(IMP).应用IMP研究不同遗传背景的枣树基因组的多态性，也就是说可以开发枣树基因组的IMP引物.

人们已经开发了许多基于转座元件的分子标记技术.现在经常用的分子标记技术有RAPD，AFLP，RFLP，ISSR，SSR等[11-12].AFLP，RFLP和其他技术相比操作相对复杂，RAPD存在重复性和稳定性较差的问题，而SSR要求知道重复序列的两端的序列情况，并且费用比较高，ISSR标记技术在PCR扩增时需要找到其最佳反应条件，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型.IMP分子标记是以PCR为基础的技术，有可重复性的结果，设计引物是根据MITE的TIR序列进行设计，用来检测两个相邻的MITE位点间的多态性，属于共显性的分子标记技术[13].文献[14]研究显示MITE和它的侧翼所在的部位是基因组中多态性比较高的区域，而且富含大量的AT重复序列，因而可以根据这些特点开发一些新的高效多态遗传标记IMP(inter-MITE polymorphism).而大量研究也表明IMP分子标记技术已有效用于小麦、大麦、燕麦、玉米、甘蔗等许多禾本科植物的遗传图谱的构建及遗传分析研究[13,15-16].由表3知枣树基因组内的MITEs含量为0.34%，玉米基因组内的MITEs含量仅仅为0.001%，可以看出枣树体内的MITEs含量比玉米的要高，既然IMP分子标记在玉米基因中可行，那么IMP在枣树基因组中顺利开发和实施相对来说还是可行的.虽然目前MITEs研究的进展非常迅速，但已鉴定的MITEs仍然非常有限.本文对枣树基因组中大量的MITEs的分离和鉴定进行了研究，为从表观遗传方面来研究枣树在栽培和移植过程中出现的一些变化的分子机制奠定了一定的理论基础.

总而言之，转座元件是植物基因组中非常重要的组成部分，对于植物基因组的进化以及基因表达都起着非常重要的调节作用，所以MITEs对枣树基因的表达和基因组的进化调控等方面都有非常重要的意义.如果我们不了解转座子的功能，就不可能对植物基因组的结构、功能和进化有一个明确的概念[17].因此对于转座因子的深入研究将为了解枣树基因组的组成和进化秘密提供一把密匙，也会促进枣树相关遗传育种理论与技术的进一步发展.

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(责任编辑：王浩毅)

Analysis and System Evolution of MITEs in the Genome ofZiziphusJujubaMill

LI Yonghui, FENG Aiqing, YA Huiyuan, CHENG Yanwei, LU Haipeng

(LifeScienceCollege,LuoyangNormalUniversity,Luoyang471022,China)

The evolution of the MITEs might be the important cause of Chinese jujube genome and species diversity. In order to explore the distribution, types and evolution of MITEs in jujube genome, MITE prediction software (MITE-Digger) was used to identify the MITEs sequence of jujube genome, annotated in plant MITEs classified database. The phylogenetic tree of MITEs in jujube genome was built up with MEGA 6.0. The results indicated that the MITE-Digger detected 3 230 pieces of MITE, with 1 104 679 bp bases which account for 0.34% of the whole genome. The similar sequence compared had 948 pieces of MITEs in the plant MITEs database (P-MITE).These MITEs could be categorized into five families: hAT, PIF/Harbinger, CACTA, Mutator and Tc1/Mariner. MITEs phylogenetic tree showed that MITEs of jujube genome came from a few common ancestor, and had no obvious amplification and mutation in the long-term evolution, which might be related to the diversity of jujube varieties. The findings could provide important reference for genetic resources and breeding ofZiziphusJujuba.

MITEs; jujuba genome; system evolution; IMP

2015-07-10

NSFC-河南人才培养联合基金资助项目，编号U1204307；河南省高等学校重点科研项目，编号15A2100410；洛阳师范学院省级培育项目,编号2010-PYJJ-007.

李勇慧(1977—)，女，河南孟津人，副教授，硕士，主要从事植物学生物技术研究，E-mail:huiyongli8209@126.com；通讯作者：押辉远(1977—)，河南许昌人，副教授，博士，主要从事植物辐照研究，E-mail: yahuiyuan@lynu.edu.cn.

李勇慧，冯爱青，押辉远，等.枣树全基因组MITEs成分分析与系统进化研究[J].郑州大学学报：理学版，2015,47(4)：103-107.

Q949.4

A

1671-6841(2015)04-0103-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.020