海藻酸钠浓度对新型神经组织工程支架结构与性能的影响

张 琨， 马珊珊， 孟 楠， 邢 衢， 石振庆， 关方霞

(1.郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001；2.郑州大学 第一附属医院 河南 郑州 450052)

海藻酸钠浓度对新型神经组织工程支架结构与性能的影响

张 琨1,2， 马珊珊1， 孟 楠1， 邢 衢1， 石振庆1， 关方霞1,2

(1.郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001；2.郑州大学 第一附属医院 河南 郑州 450052)

探讨海藻酸钠溶液的浓度变化对藻酸盐水凝胶新型组织工程支架结构与性能的影响.在氯化钙溶液浓度相同的条件下，改变海藻酸钠溶液的浓度，制备出不同原料配比的藻酸盐水凝胶，冷冻干燥后于光学显微镜下观察其微观结构变化，测定水凝胶的含水率与凝胶质量分数；将无菌的海藻酸钠溶液及间充质干细胞混合后，与氯化钙溶液反应得到包载干细胞的藻酸盐水凝胶，倒置荧光显微镜下观察水凝胶所释放出细胞的存活情况.在氯化钙浓度一定的条件下，随着海藻酸钠浓度的减小，水凝胶的空间网络结构由致密变得疏松，更易于细胞的生存与释放.实验表明，海藻酸钠水凝胶作为组织工程支架，用于神经损伤后修复具有较好的应用前景.

海藻酸钠； 氯化钙； 脐带间充质干细胞； 神经组织工程支架

0 引言

脊髓损伤(spinal cord injury)是一种常见的中枢神经系统损伤，具有高发性、高致残性、高耗费性和低龄化的特点，为世界性临床医学难题[1].外源性干细胞治疗脊髓损伤颇具前景，然而，对于所移植干细胞的存活与分化还缺乏有效的控制[2].如何构建神经组织工程支架、获得适宜的干细胞微环境是再生医学面临的一大挑战.水凝胶作为一种具有三维网状结构、含水量较大的聚合物/液体二元体系，其良好的机械性能、生物相容性和生物降解性，可以模仿天然的细胞外基质，用于功能分子或细胞的载体促进组织修复[3].海藻酸钠是从褐藻中提取的水溶性聚醛酸，具有良好的生物相容性，有利于神经轴突的生长和细胞的迁移.海藻酸钠水凝胶包载细胞的研究始于1980年，包载Schwann细胞能够促进损伤处的功能恢复与神经再生[4].Keren等研究发现，经改性的海藻酸钠水凝胶有利于干细胞的分化[5].海藻酸钠水凝胶联合胶质细胞源性神经营养因子，有助于促进神经功能的恢复[6].然而，适宜的结构(如孔径尺寸)是促进组织再生的关键[7]，因此，本研究通过海藻酸钠的浓度变化，探讨海藻酸钠水凝胶的交联程度对其结构与生物学性能的影响，为获得适宜的组织工程支架进行神经修复与重建提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 水凝胶的制备与微观结构的表征

固定氯化钙溶液为25 mmol/L，采用去离子水，分别配置浓度为0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%的海藻酸钠溶液.将海藻酸钠和CaCl2以一定的比例混合，凝胶化反应后制成水凝胶.将凝胶放入-20 ℃冰箱12 h后移入-80 ℃冰箱，放置12 h后使用冷冻干燥机充分干燥，在光学显微镜下观察不同水凝胶改造后的微观结构.

1.3 水凝胶含水率、凝胶质量分数的测定

取不同浓度的海藻酸钠溶液0.5 mL到EP管中，再分别加25 mmol/L的氯化钙0.5 mL进行反应.待凝胶化完全后，取出上清液并测出体积，计算得到凝胶的体积.称量得出凝胶的湿重.将凝胶冷冻干燥后，称重，得出凝胶干重.分别代入含水率、凝胶质量分数计算公式求出含水率与凝胶质量分数.

设定凝胶体积v，凝胶的湿重m′，凝胶的干重m″，含水率s，凝胶质量分数p.则含水率与凝胶质量分数的计算公式分别为： s=((m′-m″)/m′)×100% ， p=(m″/v)×100% .

1.4 脐带间充质干细胞从水凝胶中的释放与存活

取培养至第3代的脐带间充质干细胞，消化后调整细胞密度为1×105个/mL，在DMEM/F12培养基中加入10%的FBS配置完全细胞培养基，用于脐带间充质干细胞的培养.选用DMEM/F12培养基配置浓度为0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%的海藻酸钠溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌后分别与细胞悬液混合，再与无菌氯化钙溶液反应生成包载间充质干细胞的水凝胶.待凝胶形成后弃去上清液，加入新的细胞培养液，于5%CO2的细胞培养箱中37℃孵育12小时后换取新的培养液，1天后进行结晶紫染色，采用倒置荧光显微镜观察水凝胶中细胞的释放与存活.

2 结果

2.1 海藻酸钠浓度对水凝胶机械性能的影响

上式中Y为被解释变量，X为解释变量，i为样本个数，随机扰动项μ代表着那些对Y有影响但又未纳入模型的诸多因素的综合影响。为了使对模型的估计具有良好的统计性质，对无法直接观测的随机扰动项的分布，需要进行以下一些基本假定：

2.1.1 水凝胶微观结构随海藻酸钠浓度的变化 将不同海藻酸钠浓度下制备的水凝胶进行冷冻干燥后，通过光学显微镜对其形态进行观察，所得结果如图1所示.结果显示，海藻酸钠水凝胶具有“蛋盒”状结构[4]，随着海藻酸钠浓度的增加，形成的水凝胶更加规则且结构致密，相反，海藻酸钠浓度低的凝胶结构规则性变小且薄而稀疏.

2.1.2 水凝胶含水率和凝胶质量分数随海藻酸钠浓度的变化 通过对不同水凝胶进行含水率及凝胶质量分数的测定与计算，得到5组的含水率与凝胶质量分数，结果如表1所示.从表中每组实验数据的结果来分析，海藻酸钠水凝胶的含水率和凝胶质量分数均受海藻酸钠的浓度影响.当钙离子浓度不变的情况下，海藻酸钠的浓度越大时，形成的凝胶的含水率越低，而凝胶质量分数越大.这进一步说明，在一定的钙离子浓度下，海藻酸钠的浓度越大，形成的凝胶越致密.

2.2 海藻酸钠浓度对水凝胶细胞相容性的影响

在氯化钙浓度固定为25 mmol/L条件下，选用海藻酸钠质量分数为0.125%，0.25%，0.5%，1%，2%，制备包载脐带间充质干细胞的水凝胶，在细胞培养箱内培养1天后的结果如图2所示.由荧光显微镜下的图片可以发现，在海藻酸钠质量分数为0.125%，0.25%，0.5%时，水凝胶释放出大量的贴壁细胞，而0.125%海藻酸钠溶液获得的水凝胶所在孔板处的贴壁细胞数量最多；当质量分数增大到1%、2%时，贴壁细胞的数量明显逐渐减少.结果表明，在氯化钙浓度不变的条件下，海藻酸钠的质量分数变化会影响水凝胶的微观结构，进而影响所包载脐带间充质干细胞的活性.

3 讨论

海藻酸钠具有良好的生物相容性和生物降解性，在温和的条件下，易与二价阳离子发生离子交换从而经由外部凝胶化途径形成水凝胶[8].实验中采用的是最常用的控制变量法，保证其他一切变量相同，只改变海藻酸钠的浓度进行反应.在制备水凝胶过程中，测出凝胶的体积、湿重，并将凝胶冷冻干燥后称得干重，得到了凝胶的含水率和凝胶质量分数的变化结果，发现凝胶的含水率随着海藻酸钠浓度的减小而增大，凝胶的质量分数随着海藻酸钠的浓度减小而减小.这是由于实验中所选用的钙离子浓度一定的条件下，随着海藻酸钠溶液的加入，钙离子逐渐将钠离子置换出来，并交联形成三维空间网络.同时，在海藻酸钠与氯化钙溶液等体积加入的情况下，随着海藻酸钠浓度的增大，参与反应的钙离子增多，因此所形成的凝胶结构会越发致密[9]，该结果从微观结构的图片可以得到印证.因此，越多的海藻酸钠分子经离子交联形成水凝胶，则凝胶质量分数就会越大；由于海藻酸钠溶液的体积一定，因此，随着海藻酸钠浓度的增大，凝胶质量分数增大，而含水率减小.

实验中选用不同海藻酸钠浓度制备包载脐带间充质干细胞的水凝胶，在细胞培养箱内培养1天后发现，海藻酸钠浓度的变化会影响水凝胶包载脐带干细胞的活性.其中随着海藻酸钠浓度的降低，水凝胶所释放出的细胞在孔板处的贴壁数量逐渐增多，以0.125%时的贴壁细胞数量最多.这是由于在细胞培养实验中，随着培养时间的延长，离子交联网络中的钙离子扩散到周围培养基中，使得水凝胶交联网络结构发生降解[10]，细胞得以释放，而氯化钙溶液的浓度比重越低，水凝胶网络的降解会更快，细胞则更容易释放出来.

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[3] Sudhakar C K，Nitish U，Ankush J，et al．Nanotechnology Applications for Tissue Engineering[M]．Atlanta:Elsevier,2015，77-94．

[4] 王海宝，马学强．雪旺细胞-海藻酸钙凝胶移植对大鼠脊髓损伤后神经丝蛋白表达的影响[J]．中医正骨，2008，20(6)：1-3．

[5] Keren Z, Harald N, Yael B H, et al．A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation[J]．Biomaterials, 2014, 35(12)：3736-3743．

[6] Eduardo A，Pauline D B，Bernard U，et al．Injectable alginate hydrogel loaded with GDNF promotes functional recovery in a hemisection model of spinal cord injury[J]．International Journal of Pharmaceutics，2013，455(1/2)：148-158．

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[8] 余晨晨．明胶/海藻酸盐复合凝胶微球支架的构建与表征[D]．广州：华南理工大学，2014．

[9] Cristiana B da C，Darinka D K，Li W W A，et al．Influence of the stiffness of three-dimensionalalginate/collagen-I interpenetrating networks on fibroblast biology[J]．Biomaterials，2014，35(32)：8927-8936．

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(责任编辑：王浩毅)

Effect of Sodium Alginate Concentration on the Structure and Properties of a New Scaffold for Nerve Tissue Engineering

ZHANG Kun1,2，MA Shanshan1，MENG Nan1，XING Qu1，SHI Zhenqing1，GUAN Fangxia1,2

(1.SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To investigate the influence of the different sodium alginate concentration on the structure and property of hydrogel as scaffold for tissue engineering. With the same concentration of calcium chloride solution, different concentration of sodium alginate solution was mixed to prepare different types of hydrogels. The water content of hydrogel and gel mass fraction were determined, and their freeze dried microstructure changes were observed under the optical microscope.To obtain the hydrogel loading mesenchymal stem cells,the sterile sodium alginate solution and stem cells were mixed and reacted with calcium chloride solution. Then the survival cells released from the different hydrogels were observed using an inverted fluorescence microscopeation. Under the condition of certain concentration of calcium chloride, the network structure of hydrogel was becoming looser and easier for stem cells to survive and release, with the decrease of the concentration of sodium alginate. It could be concluded that sodium alginate hydrogel as tissue engineering scaffold had a good prospect for nerve injury repair application.

sodium alginate； calcium chloride； umbilical cord mesenchymal stem cells； nerve tissue engineering scaffold

2015-09-17

河南省博士后科研项目，编号2014020.

张琨(1985—)，女，河南睢县人，讲师，博士，主要从事生物医学工程研究，E-mail:zhangkun@zzu.edu.cn；通讯作者：关方霞(1969—)，女，河南渑池人，教授，博士，主要从事干细胞与再生医学研究，E-mail:guanfangxia@126.com.

张琨，马珊珊，孟楠，等．海藻酸钠浓度对新型神经组织工程支架结构与性能的影响[J]．郑州大学学报：理学版，2015，47(4)：99-102．

Q813.1，Q189

A

1671-6841(2015)04-0099-04

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.019