缺血性脑损伤模型的研究

430000　武汉市中医医院



缺血性脑损伤模型的研究

李梅芳李智杰

430000武汉市中医医院

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.06.021

缺血性脑损伤容易造成海马损伤，海马与人类记忆缺失上关系密切，损伤能够引起学习和记忆功能衰退，而海马解剖位置和纤维联系的特点，提示它在脑功能中起着关键作用。因此，在研究脑的学习和记忆的功能上海马是一个重点，加上它具有片层结构，结构相对较简单，是一个很适用的研究重点[1]，进行其研究的关键是制作其相关研究的动物模型。目前关于学习记忆研究的海马缺血性损伤的模型建立方式主要有以下几种：

1全脑缺血再灌注损伤动物模型

1.1双侧颈总动脉结扎法

一种慢性脑缺血动物模型，可参照de la Torre[2]的方法对大鼠的双侧颈总动脉进行永久性结扎(bilateral carotid artery ligation，BCAL)[3]。亦可参照Ohta等制作慢性脑灌注不足的动物模型[4]。将大鼠麻醉后仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎。缺血组大鼠缺血半球皮质、内囊区、海马区白质均出现较大软化灶，伴胶质细胞和小血管增生[5]。Tsuchiya等报道大鼠双侧颈总动脉结扎后有15个脑区的局部脑血流量降低25%～87%[6]。双侧颈总动脉结扎后反映大鼠学习能力的跳台试验和反映空间记忆能力的水迷宫试验的各项指标均有显著下降，并随时间的推移大鼠的学习记忆能力有进一步的降低[7]。

1.2双侧颈总动脉阻断并循环降压法

采用夹闭家兔双侧颈总动脉合并股动脉(兔子、猫、狗等体型较大的实验动物)或眼眶后静脉丛[8](小鼠)快速放血，造成急性脑缺血模型。脑电图、生化指标和形态学检测显示，这种模型脑缺血效果明显。但是，该模型不易进行再灌注观察。有作者采用双侧颈总动脉阻断合并控制性药物(硝普钠等)降压法[9]，制各急性脑缺血模型。缺血一定时间后恢复血液灌流，用于脑缺血再灌注损伤观察。但由于全身低血压造成心、肾和其他重要器官的损害，导致模型复杂化。

1.3体循环控制性降压复合颅内注液增压法

李成辉等通过给狗快速滴注0.02%硝普钠溶液，使其平均动脉压(MAP)于2～3 min内降至6. 65 kPa，之后向小脑延髓池快速注入脑脊液近似溶液，使颅内压(ICP)于5 s内升高至13. 3 kPa[10]。这样由于降低MAP而使脑灌注压下降，同时升高颅内压使脑灌流阻力增大，导致脑血流阻断，造成脑缺血。维持MAP及ICP于上述水平一定时间后颅内减压使ICP降至正常水平，即可恢复血液灌流。经组织学、生理学、生物化学及放射性同位素等多项技术检测，证明应用体循环降压结合颅内增压技术制造的脑缺血再灌注损伤模型，具有缺血效果可靠、并发症少等优点，用作脑复苏的实验研究。但该模型不适用于大鼠等小动物，并且也具有因全身性低血压导致其它脏器损伤，而使模型复杂化的缺点。

1.4四动脉结扎法

Pulsinelli[11]和De Ryck[12]等1979年首先报道了采用电凝固Wistar大鼠双侧椎动脉合并结扎双侧颈总动脉，一定时间后再解除两侧颈总动脉结扎进行再灌注，从而造成严重大脑缺血再灌注损伤这种具有高度重复性的全脑缺血造模方法。Furlow[13]又用SD大鼠复制此模型并加以改进。优点：简便易行，可控制夹闭CCA时间，进行再灌注实验是研究脑缺血再灌注损伤比较常用的动物模型；缺点：操作困难，尤其是动物的椎动脉与脊髓动脉间交通支差异很大，并且动物不同种属和不同个体之间差异较大，模型的成功率较低，稳定性亦较差。

1.5三血管阻断法

Kamegama等通过电灼断基底动脉、同时夹闭两侧颈总动脉的方法复制全脑缺血模型，由于该方法不仅阻断了脑供血主血管，而且也阻断了从脊前动脉来的侧支血管，与前述四血管阻断模型比较，脑缺血成功率高且无需再筛选是其主要优点。田鹤邨等在此基础上又加以改进，不用显微镜而在自视下进行手术，用特制的动脉夹夹闭基底动脉而不用电灼断的方法；缺血一定时间后去除夹闭进行彻底再灌注，也避免了灼断基底动脉导致的动脉损伤、出血之弊，造成的缺血和再灌流效果迅速、稳定性好；使用过程中全身动脉血压一自稳定在生理范围内，从而避免了由全身动脉压降低引起再灌流时脑血流灌注压不足，是其又一个比较突出的优点[14]。

1.6六动脉阻断法

在四血管阻断法造模的基础上加以改进，将传统的双侧颈总动脉阻断改为双侧颈内动脉和颈外动脉阻断再加双侧椎动脉阻断。该方法由于颈动脉阻断的部位是在颈动脉窦的远心端，使颈动脉窦区能维持一定的压力。这就避免了传统的四血管法阻断双侧颈总动脉，因双侧颈动脉窦区压力同时骤降，导致全身血压反射性升高，引起脑侧支循环开放增加和脑血流增加，进而使脑缺血程度减轻等弊端。但该方法手术过程比较复杂、难度较大。

1.7颈动脉分流法

采用结扎左侧颈总动脉、同时从右侧颈总动脉远心端放血，使大脑两侧颈总动脉来的血供停止，制造全脑缺血模型。此时虽然两侧椎动脉的血流仍能通过基底动脉流向大脑Willis环，但由于从右侧颈总动脉远心端进行放血，引起该侧颈总动脉、颈内动脉和后交通动脉压力显著降低。因而，当基底动脉的血流进入后交通动脉后，并不向前灌注大脑，而是逆行经颈内动脉的颈总动脉流出，导致大脑缺血。从颈总动脉放出的血液又经同侧股静脉输入体内。整个过程中可有效地控制血液流量和速度。该模型的优点在于不影响基底动脉和椎动脉的血流量，脑干缺血不明显，对呼吸、循环等基本生命活动的影响较小。再灌流时停止右颈总动脉放血，使右颈总动脉、颈内动脉和后交通动脉的低压消失，由基底动脉来的血流能够进入Willis环；同时解除左侧颈总动脉结扎，恢复其血液灌流。这样大脑便有了足够的血液灌注，即再灌流充分是其又一特点。但对于这种造模方法所导致的脑缺血范围尚有争议。有研究显示，这种缺血主要是右侧大脑中动脉供应的脑区缺血。造成这一差异的原因可能与放血速度、颈内动脉压力降低程度不同等有关。

1.8颈动脉负压分流法

实验大鼠以戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉。从左股静脉注入肝素(180 U)后缓慢注入生理盐水，夹闭两侧颈总动脉，从右颈外动脉持续抽吸颈总动脉内血液(0.3 ml/min)，此为脑缺血开始；同时自左股静脉持续回输血液，全脑缺血20 min后停止抽血，向颈动脉内注入1 mL生理盐水，结扎颈外动脉，松开两侧颈总动脉，此为再灌注开始[15]。

2局灶性脑缺血再灌注损伤造模方法

建立大脑局灶性缺血与再灌注损伤动物模型，是研究缺血性脑卒中的病理生理机制及其防治的重要手段之一。大脑中动脉(MCA)是人类脑梗塞的血管病变多发部位。由于大鼠脑血管解剖接近人类，血管性损伤恒定，重复性好等优点。因而，大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型是比较公认的研究脑缺血损伤的标准动物模型。对于局灶性脑缺血模型的制备，目前比较常用的有开颅法、插线法、光化学诱导法和栓塞法等造成大鼠MCA血流阻断与再通，从而导致其相应灌流区域局灶性脑缺血再灌注损伤。

2.1开颅法

多数研究选择颞下部开颅，通过电凝或丝线结扎横过嗅束外缘或内缘处的MCA，造成脑梗塞。Kader等对电凝闭塞MCA方法加以改进，闭塞MCA所有可见分支，梗塞效果更好。开颅法MCAO模型缺血效果可靠，是迄今应用最广泛的经典局灶性脑缺血模型。但开颅创伤大，脑脊液外漏，易感染，改变了脑微环境，手术难度较大和MCA闭塞后无法观察再灌注损伤效应。虽然有作者通过用微型动脉夹夹闭或通过穿线抬起MCA造成短暂脑缺血，然后使血流再通制作再灌注模型，但也只限于短时间MCAO后再灌注损伤的研究，技术上尚待进一步改进。

2.2微栓子栓塞阻断法

自颈外动脉(ECA)向颈总动脉(CCA)逆行插管并注入大鼠自体血凝块碎片与生理盐水配制的混悬液，可造成颈内动脉(ICA)系统，主要是MCA供血区的缺血性损害，梗死灶位于同侧大脑皮质、基底节及海马等部位。有人报道，也可利用硅酮微球、碳粒微球或CCA自发性脱落的血栓栓子栓塞一侧MCA。这种栓塞性脑梗死模型很接近人类自然栓塞现象，成功率高，手术创伤较小[16]。但也存在诸如不能预见缺血部位和范围、不能控制再通、对侧亦可能受累以及可能导致外源物质引起的炎症反应等缺点[17-18]。故此法仅限于一些特殊研究的应用，如溶栓治疗及血小板微血栓形成后的脑病理改变及功能变化研究等[19]。

2.3插线法

Kuizumi于1986年首次报道了尼龙线插线法制作的可逆性MCAO模型，解决了局灶性脑缺血再灌注损伤研究的难题。若手术选择颈部旁侧手术入路，可使手术视野暴露更好，便于血管分离，并且较颈部正中切口对气管刺激小，无需再行气管造疹，使手术相对较简单。病理检查结果显示，造模动物均存在缺血侧尾壳核及背外侧皮层梗塞，病变一致、稳定性好，缺血效果可靠。尤其适用于基底节缺血再灌注的病理生理机制的研究和药物治疗效果与机制的观察。此外，无需开颅、创伤小，栓线闭塞MCA后不引起血压、血气和体温的异常变化，不影响缺血后脑水肿和颅内压病理变化的自然过程等优点，均优于开颅闭塞MCA法建立的局灶性脑缺血模型[20]。

Zea Longa线栓法[21]：该模型的制备方法是将动物麻醉后颈后正中切开，电烧双侧椎动脉局阻断后循环；前正中切开，暴露左侧CCA、ICA和ECA，以微血管夹将CCA夹闭，将单股尼龙线(4-0)插入ICA远端，大脑中动脉起始部阻断血流/平均进线长度为(2±0.2)cm。

2.4栓塞法

这种造模方法是将栓塞剂(如碎血凝块、碳素颗粒、花生四烯酸盐等)注入血管，制成脑栓塞模型。将无菌干燥的血凝块研碎，制成栓子混悬液。从颈外动脉注入栓子后，结扎颈外动脉并放开总动脉，栓子冲入颈内动脉并进入MCA。该模型不需开颅，制作简单，缺血效果可靠。且与临床栓塞性脑卒中病理过程最为相似，比较适用于溶栓治疗的观察研究，尤其选用人血凝块作为栓塞剂更具有实用意义。其缺点是由于栓子的随机性较大，无法精确预测梗塞的部位和范围大小。也有研究人员应用气囊栓塞法，但仅能用于大动物如狒狒、家兔等。

2.5Endothelin-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型Sharkey等建立了ET-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型[22]，国内外己有人采用该法进行了缺血性脑损伤的研究[23]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 m1/kg)麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪上，以热垫维持肛温37.0～38.0℃，沿正中线切开头皮暴露颅骨，参照大鼠脑立体定位图谱以前囱为标志，头端0.9 mm，右侧开5.2 mm，颅骨下8.7 mm处植入一导管，5 min后将稀释的不同浓度ET-1(4.0 μL)以1.0μL/ min速度注入到MCA附近：同时行尾动脉插管术监测给ET-1前、后大鼠尾动脉血压变化。与普遍应用的插线法相比，本模型仅涉及简单的立体定位和开颅术，不会造成脑内较大动脉的损伤，减少了颅内出血的危险；再灌注的发生是一个渐进过程，避免了人为再灌注引起的CBF急剧增加，较符合人类脑卒中溶栓后CBF逐渐恢复的情况；开颅范围小(直径0. 65mm)，不会造成脑内环境的较大变化；产生与插线法类似的较稳定的梗死范围且具有良好的重现性。此外，本模型的最大优点是可以对清醒动物进行缺血性脑损伤的研究，因此本模型对脑缺血再灌注机制的研究及脑保护新药疗效的评估而言是一种较理想的局灶性脑缺血再灌注模型。

3离体组织培养脑缺血再灌注损伤造模方法

海马脑片抽氧缺糖模型：脑片的制作方法为取出生6～9 d SD大鼠，剥离出海马，切成400 μm厚制成脑片培养液，放入插入微孔滤膜，再置入培养箱中，2周后加入碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)，再孵育1 h，选取完好无PI特异荧光着色的脑片。海马脑片缺氧缺糖模型的制作方法有多种，目前运用较多的有浸没法、充N2法和三气缺氧培养箱法。浸没法：将脑片换入内、外各含有1.2 mL无糖平衡盐溶液的微孔滤膜上，再放入培养箱中分别培养30、45 min、1、1.5 h。充N2法：先将脑片用HEPES液冲洗，再放入含有1.2 mL HEPES缓冲液的微孔滤膜内，然后放入密闭容器中，分别持续充入5% CO2、95% N2的混合气体30、45 min、1、1.5 h。三气缺氧培养箱法：将脑片放入只有外侧含有1.2 mL无糖平衡盐溶液的微孔滤膜上，再放入5% CO2、1% O2、94% N2的三气缺氧培养箱内分别缺血缺氧培养30、45 min、1、1.5 h。目前普遍认为三气缺氧培养箱法来的缺氧缺糖模型最稳定，但有实验证实将浸没法结合充N2法制作的模型与三气缺氧培养箱法在缺氧1 h的结果相似[24]，且更方便实用。有实验证实离体海马脑片缺氧缺糖培养模拟“脑缺血”，可以重现在体动物实验时海马各区对缺血敏感性不同的特点[25]，这种方法正在逐步取代动物体内缺血模型。朱洁等在此基础上发明了改良的新生大鼠海马脑片缺氧缺糖巧匠制备方法，使得该方法应用更加经济广泛[26]。还有人认为从成年小鼠海马脑片培养细胞损伤的评价将会成为研究神经保护作用的一个潜在模型系统[27]。

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(2015-03-02收稿2015-03-20修回)

【中图分类号】R743

【文献标识码】A

【文章编号】1007-0478(2015)06-0385-04