HPV18 E7抗原T细胞表位的鉴定及CD4+T淋巴细胞的免疫反应

余剑琴 徐云升 欧荣英 张乾 郑飞云

HPV18 E7抗原T细胞表位的鉴定及CD4+T淋巴细胞的免疫反应

余剑琴 徐云升 欧荣英 张乾 郑飞云

目的 初步鉴定人乳头瘤病毒（HPV）18型E7抗原的辅助T淋巴细胞（Th）表位及CD4+T淋巴细胞的免疫反应。方法 以免疫磁珠进一步分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞（PBMC）中的CD4+T淋巴细胞，流式细胞仪鉴定细胞纯度，用之前实验中已获得的3个HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位刺激外周血CD4+T淋巴细胞，用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）检测CD4+T淋巴细胞增殖活性。ELISA方法分析表位刺激CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子。结果 多肽P1（HPV18 E780-94）在体外刺激CD4+T淋巴细胞后能够有效诱导CD4+T淋巴细胞增殖，P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），多肽P1（HPV18 E780-94）刺激CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ，P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 P1（HPV18 E780-94）可能为HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位。

人乳头瘤病毒 E7抗原 CD4+T淋巴细胞 Th表位

宫颈癌是女性最常见的的恶性肿瘤之一，发病率居女性癌症的第2位，死亡率居女性癌症的第3位[1]。2012年国际癌症研究机构确定了导致宫颈癌的12种人乳头瘤病毒（HPV）基因型，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV59，而HPV18是世界大部分地区宫颈癌患者中次于HPV16的第2位常见高危HPV，HPV18较HPV16具有更强的恶性转化能力，与宫颈腺癌显著相关，利用其制备的疫苗可能对肿瘤具有治疗作用[2]。我们在前期研究中采用SYFPEITHI预测软件，对靶抗原HPV18 E7的HLA-DRB1*0301限制性Th表位进行预测及预测肽合成、纯化及质谱鉴定，用合成的多肽在体外刺激人外周血单核细胞（PBMC），结果表明预测获得的其中1个候选表位能刺激淋巴细胞增殖[3-4]。为了进一步验证候选表位是否能刺激CD4+T淋巴细胞增殖，我们进一步进行了CD4+T淋巴细胞增殖试验并检测其极化方向，为进一步研制HPV18治疗性表位疫苗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 由Genbank获得的HPV18 E7抗原由105个氨基酸组成，其序列见文献[4]。将HPV18E7抗原氨基酸序列输入SYFPEITHI网站工作，筛选并合成出3条HLA-DRB1*0301限制性多肽，P1（80-94）ADDLRAFQQLFLNTL，P2（72-86）IELVVESSADDLRAF，P3（18-32）QNEIPVDLLCHEQLS，分离HLA-DRB1*0301阳性健康人PBMC，为本实验准备，详见文献[4]。

1.2 试剂 Dynal CD4+T淋巴细胞阴性分选试剂盒及Dynal MPC-15磁性分离架购自挪威Dynal公司，5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）购自德国Roche公司，流式细胞仪由美国Becton Dickinson公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 Dynal免疫磁珠分离CD4+T淋巴细胞及纯度鉴定使用Dynal CD4+T淋巴细胞阴性分选试剂盒分离PBMC，分离后所得CD4+T淋巴细胞用流式细胞仪计数并鉴定纯度，分析软件为Cell Quest V3.2。同时检测分离前后CD4+T淋巴细胞活力。

1.3.2 CD4+T淋巴细胞增殖实验 为了进一步验证P1、P2、P3三个多肽是否能刺激CD4+T淋巴细胞增殖，本实验进一步进行了CD4+T淋巴细胞增殖试验。（1）辅助细胞的处理：将分离得到的PBMC接种于25ml培养瓶中，37℃、95%湿度、5%CO2培养箱中培养12h后经直线加速器照射（30Gy）去增殖，作为抗原递呈细胞（APC）。（2）CD4+T淋巴细胞培养：调整CD4+T淋巴细胞浓度为2×106/ml，PBMC浓度为4×106/ml，于96孔平底培养板，每孔加入CD4+T淋巴细胞2×105、照射过的PBMC 2× 105，同时分别加入稀释好的合成多肽P1、P2、P3各10μg/ml（下文简称P1组、P2组、P3组）；阴性对照孔只加稀释液，不含合成多肽（NC组）；阳性对照孔加入植物血凝素（PHA），终浓度10μg/ml；空白孔为不含细胞的IMDM培养液；同时设立CD4+T淋巴细胞加合成多肽（P1、P2、P3）及APC加PHA的对照孔，终体积为200μl。每组做3个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养6 d，培养结束前24 h加入BrdU20μl。用酶标仪测定吸光度（OD）值，OD值＝实验组OD值－空白对照组OD值。

1.3.3 ELISA法检测细胞因子 为了分析筛选出的表位肽诱导CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子，采用ELISA法检测多肽与CD4+T淋巴细胞共培养上清液中的细胞因子。将CD4+T细胞悬液调成细胞浓度为1×106/ml，经照射的PBMC悬液调成细胞浓度为1×106/ml；各取100μl铺于24孔培养板，加入合成多肽（10μg/ml），总体积0.5ml/孔；阴性对照孔只加稀释液，不含合成多肽。每组做3个平行孔，37℃、95%湿度、5%CO2培养72h。培养结束后离心，1 500r/min，5min，收集细胞悬液400μl置入Eppendorf管，上清液用ELISA法测定细胞因子IFN-γ、IL-10和IL-4表达情况。

1.4 统计学处理 使用SPSS12.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 CD4+T淋巴细胞纯度 用PE标记的抗人CD3和FITC标记的抗人CD4加入PBMC分离前后试管，经流式细胞分析，可见分离前CD4+T淋巴细胞纯度为45.25%，分离后的纯度达到90.71%以上，可以进行后续实验（图1）。

2.2 细胞悬液中CD4+T淋巴细胞的活力 台盼蓝拒染法计数细胞总数及死细胞数，计算细胞活力，免疫磁珠分离前后CD4+T淋巴细胞的活力分别为（96.15±2.36）%及（94.32±3.11）%，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 CD4+T淋巴细胞增殖情况 分离的CD4+T淋巴细胞与照射后的PBMC及合成多肽共同培养，结果显示P1能刺激CD4+T淋巴细胞增殖，NC组与P1组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。PBMC在此作为APC辅助多肽刺激CD4+T淋巴细胞增殖，经直线加速器照射可以抑制其增殖，用PHA刺激照射的PBMC（即APC）不能使其增殖。APC＋PHA组及未经照射PBMC+PHA组OD值分别为0.228±0.010、0.930±0.045，两组的差异有统计学意义（P＜0.01），说明体系中增殖的细胞为CD4+T淋巴细胞；在CD4+T淋巴细胞增殖实验时同时还设立了CD4+T淋巴细胞加抗原的对照，发现在缺乏APC的情况下CD4+T淋巴细胞也不能增殖；P1（CD4+＋PBMC＋多肽）组与CD4+＋P1多肽组比较差异有统计学意义（P＜0.01），表明多肽刺激CD4+T淋巴细胞增殖需要APC的辅助，而不是非特异性的刺激反应。详见图2。

2.4 ELISA法检测多肽刺激淋巴细胞增殖后的细胞因子表达情况 P1能刺激CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ，P1组与NC组及P2组比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），P1组与P3组比较差异也有统计学意义（P＜0.05）；而P1、P2、P3组与NC组比较，IL-10、IL-4水平的差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见图3。此结果表明P1能刺激Th0细胞向Th1细胞分化。

图1 流式细胞术鉴定免疫磁珠分离前后CD4+T淋巴细胞的纯度（A：分离前；B：分离后）

图2 不同多肽刺激CD4+T淋巴细胞增殖结果的比较

3 讨论

高危型HPV持续感染是宫颈癌发生的始动因子，宫颈癌的发生要经过一个较长的癌前病变阶段，在这个阶段可通过免疫学手段来帮助清除体内病毒，这就需要寻找HPV治疗性疫苗。其中合成多肽疫苗安全，容易储存和处理，有理想的靶特异性，是一类很有潜力的疫苗。目前对HPV16治疗性多肽疫苗研究较多，而37%～41%的宫颈腺癌是由感染HPVl8引起[5]，因此，目前HPV18疫苗的研制和开发正日益受到关注。Th表位是外源蛋白经APC处理后与MHC-Ⅱ类分子结合并提呈到细胞表面供CD4+T淋巴细胞识别的短肽，其引发的CD4+T淋巴细胞应答对于辅助B细胞及CTL发挥效应具有重要作用。本研究结果也显示，多肽刺激CD4+T淋巴细胞增殖需要APC的辅助，而不是非特异性的刺激反应。

图3 不同多肽刺激CD4+T淋巴细胞增殖后细胞因子表达结果的比较

Zhao等[6]以重组痘苗病毒rVVJ18 E7、E6多肽分别免疫C57BL/6和BALB/c小鼠，检测其所诱发的细胞免疫反应，结果表明重组痘苗病毒rVVJ18 E7、E6免疫的两种品系小鼠均可测到E6肽库刺激产生的特异性细胞免疫反应，筛选确定2种多肽为CD8的T细胞表位。本研究结果显示，通过体外HPV18E7抗原多肽刺激CD4+T淋巴细胞，可检测到细胞增殖及细胞因子分泌，根据此文献可进一步做动物实验验证。

以往有关HPV治疗性多肽疫苗的研究主要是针对HLA-A2限制性CTL表位开展的。Ramos等[7]在体外试验中，给予由11个氨基酸组成的HPV16 E6/E7抗原肽（来自多肽库）刺激68例HPV相关肿瘤患者的PBMC及PBMC衍生的树突状细胞，发现HPV16 E6/E7能诱导PBMC产生特异性的CTL增殖，并能够分泌IFN-γ及IL-6等细胞因子，以上结果表明，HPV16 E6/E7多肽抗原在体外能诱导淋巴细胞产生免疫反应，与本研究的结果一致。

近年的研究策略已开始关注CD4+T淋巴细胞对HPV感染的影响。Zwaveling等[8]的研究表明，CpGDNA同HPV16 E743-77（含有H-2Kb限制性CTL表位HPV16 E749-57及Th表位E748-54）35肽合用，可使10只宫颈癌移植瘤小鼠中的8只肿瘤完全消退，另2只小鼠的肿瘤生长也较对照组缓慢，而CpGDNA同HPV16 E749-57肽合用仅能使9只宫颈癌移植瘤的小鼠中的3只肿瘤完全消退。Kim等[9]将巴氏涂片异常而行阴道镜组织活检的患者分为两组，一组是活检为CIN1,2,3为persistors组（n=51），另一组是活检正常为regressors组（n=33），检测INF-r、Tregs，结果表明regressors组CD4+T淋巴细胞反应比persistors组高，两者差异有统计学意义（P=0.015）。以上研究结果说明CD4+T淋巴细胞免疫反应在肿瘤免疫中起关键性作用。本研究结果显示，多肽P1（HPV18 E780-94）在体外刺激CD4+T淋巴细胞后能够有效诱导CD4+T淋巴细胞增殖，为今后以表位为基础的HPV疫苗设计提供了实验依据。

本研究选用BrdU比色法。BrdU与胸腺嘧啶具有结构的相似性，能代替胸腺嘧啶掺入S期细胞新合成的DNA链内。近年来进一步证实，3H-TdR和BrdU所标记的S期细胞结果完全一致，但BrdU更具有省时、简便、重复性好和无放射性等优点，BrdU具有更高的敏感性和可重复性。本研究采用淋巴细胞功能试验验证的方法鉴定出HPV18 E7抗原Th表位。在预测获得的3条多肽中，经淋巴细胞增殖试验证实P1能刺激淋巴细胞增殖。结果表明，经P1刺激后CD4+T淋巴细胞的比例较培养前以及未加多肽刺激的对照组均有明显增加，未加多肽刺激的对照组相对培养前无明显增加。同时经细胞因子检测，可以得出HPV18 E780-94能诱导活化CCD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ。

综上所述，本研究初步证实E780-94是HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th1表位，为今后评价E7蛋白的细胞免疫效果提供了实验依据。

[1] Siddiqa A,Zainab M,Qadri I,et al.Prevalence and genotyping of high risk human papillomavirus in cervical cancer samples from Punjab,Pakistan[J].Viruses,2014,6(7):2762-2777.

[2] Liu TY,Hussein WM,Jia Z,et al.Self-adjuvanting polymer-peptide conjugates as therapeutic vaccine candidates against cervicalcancer[J].Biomacromolecules,2013,14(8):2798-2806.

[3]张乾,郑飞云,徐云升,等.HPV18 E7抗原HLA-A2限制性CTL表位的初步筛选[J].温州医学院学报,2007,37(2):100-103.

[4]余剑琴,郑飞云,徐云升,等.HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的筛选与鉴定[J].温州医学院学报,2008,38(3):193-196.

[5] Clifford G M,Smith J S,Plummer M,et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide:a meta-analysis[J].Br J Cancer,2003,88:63-73．

[6] Zhao L,Ren J,Feng J,et al.Identification specific T lymphocyte epitopes on E6 protein ofhumanpapillomavirus type 18 in mice[J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi,2010,24 (6):406-408.

[7]Ramos C A,Narala N,Vyas G M,et al.Human papillomavirus type 16 E6/E7-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive immunotherapy of HPV-associated malignancies[J].J Immunother, 2013,36(1):66-76.

[8] Zwaveling S,Ferreira Mota S C,Nouta J,et al.Established human papillomavi- rus type 16- expressing tumors are effectively eradicated following vaccination with long peptides[J].J Immunol, 2002,169(1):350-358.

[9]Kim KH,Greenfield WW,Cannon MJ,et al.CD4+T-cellresponse against human papillomavirus type 16 E6 protein is associated with a favorable clinical trend[J].Cancer Immunol Immunother, 2012,61(1):63-70.

Identification of specific T lymphocyte epitope on E7 antigen of human papillomavirus type 18 and CD4+T-cell response

YU Jianqin, XU Yunsheng,OU Rongying，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China

Objective To identify specific T lymphocyte epitope on E7 antigen of human papillomavirus type 18 and CD4+T-cell responses. Methods Three epitope candidates of human papillomavirus 18 E7 antigen(P1,P2 and P3)were obtained previously.Peripheral blood mononuclear cell(PB MC)from HLA-DRB1*0301-positive healthy donors were prepared and CD4+T cells were separated by Dynal Immunomagnetic beads isolation.The purity was determined by flow cytometry.The predicted peptides were scored as immunogenic ability to stimulate CD4+T cells.Proliferative activity was analyzed with Brdu cell proliferation assay.The cytokine production of CD4+T cells induced by the peptides was detected by ELISA. Results Peptide P1 (HPV18 E780-94)stimulated proliferation of CD4+T cells and the OD value was significantly higher than that of negative control group(P＜0.01).Peptide P1(HPV18 E780-94)also stimulated CD4+T cells to secrete IFN-γ and IFN-γ value was significantly higher than that of negative control group(P＜0.01). Conclusion Peptide P1(HPV18 E780-94)can be the HLA-DRB1*0301-restricted Th epitope of human papillomavirus 18 E7 antigen,which provides the basis to evaluate cellular immune response elicited by HPV18 E7 protein based vaccine.

Human papillomavirus E7 antigen CD4+T cells T lymphocyte epitopes

2015-01-21）

（本文编辑：沈叔洪）

国家自然科学基金项目（30500537）

325000 温州医科大学附属第一医院妇产科（余剑琴、欧荣英、张乾、郑飞云），皮肤科（徐云升）

郑飞云，E-mail：ZFY@hosp1.ac.cn