亚急性铜、镉暴露对鲤肝脏Hsp60表达的影响

■姜旭阳 高 雁 张 红 苗畅齐柳广昊韩 英赵 鹏

（1.东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳 110036；3.北镇市常兴店动物卫生监督所，辽宁北镇 121306）

热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）通常被用作多种应激因子的生物标记，例如温度变化、组织损伤、毒物暴露、饥饿、盐度变化以及病毒感染等[1-4]。在应激状态下，机体产生多种类型的Hsp。Hsp通过阻止外源蛋白质聚合、促进新合成蛋白质折叠和稳定并重新折叠受损蛋白等途径，在蛋白质合成中发挥重要作用[5]。在Hsp家族中，Hsp60在蛋白质折叠系统中发挥重要作用，并具有对破坏细胞内稳态的应激进行应答的能力[6]。

近年来，重金属污染日趋严重，已经成为全球性的问题。大量的研究显示，人类的活动，例如工业污水排放、采矿和废气排放等[7]，导致了生态环境中重金属浓度的升高[8]，我国作为农业大国，重金属污染对农产品的影响不容忽视，2013年发生的“镉大米”事件为我们敲响了警钟。重金属通过污染水环境和土壤，导致鱼类及农作物中重金属含量超标，人类和家畜食用后必然会对健康造成危害。鱼类作为水生生态系统的重要组成部分，极易受到重金属污染的影响，同时鱼粉作为重要的动物性蛋白添加饲料之一，在饲料行业应用广泛。因此，如何避免重金属进入生态循环已成为研究的热点。鲤是我国水产养殖的重要品种，同时也是近几年兴起的“稻田养鱼”养殖模式的主要对象之一。铜和镉是水体中非常常见的重金属，二者对水生生物的毒性研究已经很多，但是分子和蛋白水平的研究依然比较缺乏。选取鲤作为试验动物，探究铜和镉亚急性暴露对其肝脏中热休克蛋白60（Hsp60）表达的影响，从而为评估这两种重金属对鲤的亚急性毒性作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼及管理

健康鲤购于黑龙江省哈尔滨市某淡水鱼养殖基地，饲养于东北农业大学动物科技学院水产养殖实验室。试验鱼平均体重(45.3±6.7)g，体长(13.5±1.5)cm。在进行暴露试验之前，饲养于220 L水族箱14 d。每天投喂两次，每天换水一次，换水量为1/2，水温(20±1)℃。水族箱持续曝气，水中溶解氧高于7 mg/l，pH值为7.3±0.3，总硬度230 mg/l（以CaCO3计），每天光照12 h。

1.1.2 试验设计

随机选择健康鲤，分为如下7组：两个Cu2+处理组（0.05 mg/l和0.1 mg/l），两个Cd2+处理组（0.63 mg/l和1.26 mg/l），两个混合处理组（0.045 mg/l和0.09 mg/l）和一个对照组。每个处理组30尾鱼，并设置两个平行。二者的混合物由Cu2+和Cd2+按质量比1∶1组成。CuSO4·5H2O(AR)和 CdCl2·2.5H2O(AR)购于 Sig⁃ma-Aldrich(USA)公司。试验中的浓度根据Cu2+和Cd2+对鲤的96 h LC50的1/4和1/2而设置。Cu2+和Cd2+对鲤的96 h LC50的1/4和1/2在之前的研究中报道过[9-10]。我们通过预试验获得了二者混合物的96 h LC50。

1.1.3 采样

在重金属暴露的24、48、72 h和96 h时，每个处理组取5尾鱼，快速取出肝脏，放置于液氮中，最后冻存于-80℃冰箱中。

1.2 基因表达分析

1.2.1 引物设计与合成

以β-actin mRNA（基因登录序列AF057040）作为内参，根据GenBank中鲤鱼的Hsp60基因登陆序列（BC068415），用Oligo6.0软件进行引物设计(见表1)。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 鲤Hsp60基因表达所用的引物

1.2.2 总RNA提取和cDNA第一链合成

鲤肝脏总RNA的提取按照Trizol试剂盒说明书进行，cDNA第一链利用oligodT引物和Superscript II反转录酶从5 μg总RNA中合成，并稀释5倍，保存于-80℃冰箱中。

1.2.3 反转录反应

总 RNA 10 μg，加 OligodT 2 μl，加 0.1%DEPC水至总体积为22 μl，70℃作用10 min，取出后立即放在冰上进行反转录：M-MLV 1 μl，RNase Inhibitor 1 μl，dNTP 4 μl，5×Buffer 8 μl，0.1 M DTT 4 μl；37 ℃水浴1～2 h，70℃下加热 15 min使反转录酶失活，-20℃保存备用。

1.2.4 实时定量PCR扩增

用设计好的实时定量PCR引物分别扩增目的基因。定量 PCR反应采用 SYBR GreenⅠ荧光染料法。20 μl反应体系见表2。

反应在ABI 7500 Real Time PCR System上进行。反应条件为：95℃预变性 30 s，95℃ 5 s，60℃34 s，40个循环，最后为融解反应（dissociation stage）。反应所获得的扩增曲线和融解曲线用Disso⁃ciation Curve 1.0软件进行分析。mRNA相对丰度通过 Pfaffl方法计算[11]。

表2 PCR反应体系

1.3 Western blot分析

收集蛋白提取物，进行SDS-PAGE电泳。把电泳分离的蛋白进行转膜，转膜条件为：20%甲醇的Tris-glycine缓冲溶液中，100 mA进行电转2 h。后经过 5%脱脂奶粉封闭 16～24 h，并孵育Hsp60蛋白一抗（1∶100）过夜，随即进行辣根过氧化物酶标记二抗孵育（1∶1 000）。本试验采用β-actin做为内参蛋白。最后进行X胶片曝光显影。X胶片曝光显影后，Image VCD gel imaging系统扫描蛋白条带光密度值（OD），Hsp60蛋白表达情况用 Hsp60条带OD值/β-actin条带OD值表示。

1.4 数据分析

所有数据的统计学分析应用SPSS 13.0软件进行分析。并应用Prism 5.0对试验数据进行作图。所有数值均表示为“Mean±SD”的形式。P＜0.05被认为存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 重金属暴露对肝脏Hsp60基因表达的影响（见图1）

图1 铜、镉单一及联合亚急性暴露对鲤肝脏Hsp60基因表达水平的影响

图1结果表明，铜低浓度组Hsp60基因表达量在96 h内均无明显变化；铜高浓度组中，48 h后Hsp60基因表达量开始显著升高（P＜0.05），在96 h时达到最高峰；镉低浓度组中，24 h后Hsp60基因表达量显著升高（P＜0.05），在96 h时达到顶点；镉高浓度组与镉低浓度组变化趋势类似；混合低浓度组中，48 h后Hsp60基因表达量显著升高（P＜0.05），96 h时变化不显著（P＞0.05）；混合高浓度组中，48 h后Hsp60基因表达量显著升高（P＜0.05），在96 h时达到最大值。

2.2 重金属暴露对鲤肝脏Hsp60蛋白水平的影响（见图2、图3）

结果表明，铜低浓度组中，24 h时Hsp60蛋白水平显著低于正常水平（P＜0.05），并随时间缓慢呈缓慢上升趋势，96 h时达最高点，但仍低于对照组水平；铜高浓度组中，Hsp60蛋白水平均低于对照组水平，96 h时接近对照组水平；镉低、镉高浓度组与铜高浓度组变化趋势类似；混合低浓度组中，Hsp60蛋白水平均高于对照组水平，96 h时显著升高（P＜0.05）；混合高浓度组与低浓度组类似。

图2 铜、镉单一及联合亚急性暴露对鲤肝脏Hsp60蛋白水平的影响

图3 肝脏中Hsp60 Western blot检测结果

3 讨论

3.1 重金属暴露对鲤肝脏Hsp60基因表达的影响

本研究结果表明，除了铜低浓度组，其余所有处理组鲤肝脏Hsp60基因表达水平相比于对照组均有不同程度提高，并随时间逐渐升高，在96 h达到最大值。这说明铜、镉及二者混合物的亚急性暴露对鲤产生毒性作用，并导致肝脏中Hsp60基因表达水平升高。刘海超等[12]研究发现，铜暴露后48 h Hsp60 mRNA表达水平显著上调，约为对照组的3.4倍，并随着时间的延长在暴露96 h显著上调并达到峰值，约为对照组的14.6倍。我们的试验获得了类似的结果，同时也印证了肝脏Hsp60对铜的诱导较为敏感。但我们的试验结果中96 h峰值较低，不同物种、不同条件下Hsp表达的差异性可能是其原因[13]，同时鲤耐受力较强也可能导致这种现象的发生。由结果中可以看出，镉处理组Hsp60基因表达水平升高显著，这表明镉暴露同样诱导了鲤肝脏中Hsp60基因的过表达。铜、镉联合暴露组中，低浓度组Hsp60基因表达水平升高不显著，而高浓度组显著提高，这说明两种重金属联合暴露对鲤的毒性作用不同于单一重金属暴露，鲤机体对这两种金属胁迫的应答可能既存在相加作用，又存在拮抗作用，确切的机制仍需要进一步研究。

3.2 重金属暴露对鲤肝脏Hsp60蛋白水平的影响

由Western blot分析结果可以看出，两种重金属的急性暴露，导致短期内鲤肝脏Hsp60蛋白水平低于对照组水平，这同之前报道的唐鱼中Hsp70蛋白表达模式一致[14]。正常情况下，细菌和真核生物中，蛋白水平同相应的mRNA水平密切相关[15]。相反地，有研究发现当机体处于应激状态时，会出现基因表达水平与蛋白水平不一致的现象[16]。Quirós等[17]研究发现，马鲅（Barbusgraellsii）肝脏中金属硫因蛋白水平同相应的基因表达没有明显的相关性(P＞0.05)。我们的结果与其相似，这可能是重金属暴露造成Hsp损伤，或者Hsp用于修复受损蛋白而产生消耗，同时也体现了Hsp作为分子伴侣的功能。在暴露后期，Hsp60蛋白水平均有不同程度升高，混合暴露组显著高于对照组（P＜0.05），这表明机体处于环境胁迫状态，需要大量的Hsp60来维持机体稳态，体现了Hsp作为生化标记物的功能。

4 结论

①铜、镉单一及联合亚急性暴露对鲤产生毒性作用，在除了混合低浓度组的其他处理组中，鲤肝脏中Hsp60基因表达水平均有显著升高（P＜0.05）。

②受铜、镉单一及联合亚急性暴露的影响，随着暴露时间的延长，鲤肝脏中Hsp60蛋白水平从低于对照组水平开始逐渐上升，并达到或超过对照组水平，96 h时混合低浓度组显著高于对照组（P＜0.05）。基因表达水平与相应蛋白水平不一致的现象确实存在，确切机制仍需进一步研究。