GC法同时测定聚山梨酯80中5种挥发性杂质

李 莉，王佳宇，高山山，侯文珍，马长华（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

·药物分析·

GC法同时测定聚山梨酯80中5种挥发性杂质

李 莉，王佳宇，高山山，侯文珍，马长华＊（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

目的 建立气相色谱法对聚山梨酯80中的环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇和二甘醇5种挥发性杂质进行同时检测。方法 采用气相色谱法，色谱柱固定相为PEG20000（GsBP－INOWAX，30m×0.53mm×1.0μm弹性石英毛细管柱）。采用程序升温，初温50℃，以5℃·min－1升温至200℃，保持10min，再以50℃·min－1升温至230℃，保持20min。进样口温度为200℃，检测器温度为250℃。结果 同时测定了聚山梨酯80中环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇和二甘醇5种挥发性杂质，线性范围分别为2.7～176.8μg·mL－1（r＝0.999 8），2.8～140.7μg·mL－1（r＝0.999 8），3.4～167.5μg·mL－1（r＝0.999 9），4.7～2 345μg·mL－1（r＝0.999 8）和3.2～160.8μg·mL－1（r＝0.999 9）；平均加样回收率分别为104.3%，91.3%，105.2%，94.1%和105.7%，RSD分别为2.5%，2.8%，1.4%，3.0%和3.7%。结论 该方法灵敏、准确，可用于聚山梨酯80中挥发性杂质的检测。

聚山梨酯80；挥发性杂质；气相色谱法

聚山梨酯80（Tween－80，polysorbate 80）是一种非离子型表面活性剂，由于其结构中具有较长的碳链结构，对亲脂性药物有较好的助溶作用，因此该产品常被用作注射液及口服液的增溶剂或乳化剂［1－2］。但近年来临床上含聚山梨酯80的注射剂多有不良反应发生，如：因严重不良反应被国家食品药品监督管理局暂停使用的鱼腥草注射液，其中所含辅料聚山梨酯80就是引起不良反应的重要原因之一［3］。据豚鼠、Beagle犬、食蟹猴、体外RBL－2H3细胞、人血清补体等大量实验研究证实，聚山梨酯80与动物不良反应的出现存在明显关系；聚山梨酯80是一种聚合物，稳定性不佳，其含有的杂质或降解产物可能是致敏的主要原因［4］，如环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇等［5］，而该类物质在相关药理学研究中已被证明，对机体神经、细胞等存在不良反应［6－9］。因此，对聚山梨酯80中可能含有的该类潜在不良反应因素的监控，对于保证临床用药安全具有重要的意义。由实验结果可知，建立测定5种杂质的气相色谱方法简便灵敏，结果准确，重复性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦气相色谱仪，型号7890A（FID检测器，安捷伦自动进样器型号7683B）；电子天平（上海越平科学仪器有限公司，型号JA2003）。

1.2 试药 对照品：氯乙醇（Sigma公司进口分装，规格1mL）；乙二醇（上海源叶生物科技有限公司，规格5mL）；二氧六环（中国食品药品检定研究院，规格200mg）；二甘醇（中国食品药品检定研究院，规格100mg）；环氧乙烷（中国食品药品检定研究院，规格5mL）。聚山梨酯80（批号205359C，日本NOF公司；批号20130701，南京国内某公司注射级别；批号ZY130911，上海国内某公司药用级别；批号20130101，20130401，20101201，国内某公司）。无水乙醇（色谱级别，Fisher公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密吸取环氧乙烷、氯乙醇、乙二醇、二氧六环、二甘醇对照品，分别加无水乙醇配制成每1mL含氯乙醇50μg、二醇800μg、二氧六环50μg、二甘醇50μg和环氧乙烷44.2μg的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取聚山梨酯80 4 g，置于10mL量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，配制成每1mL含400mg聚山梨酯80的供试溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱固定相为PEG20000（GsBPINOWAX，30m×0.53mm×1.0μm弹性石英毛细管柱）。采用程序升温，初温50℃，以5℃·min－1升温至200℃，保持10min，再以50℃·min－1升温至240℃，保持20min。进样口温度为200℃，检测器温度为250℃，分流比为10∶1，进样量1μL，柱压力恒定方式，载气为氮气（99.999%），柱流速3mL·min－1。色谱图见图1。

图1 气相色谱图A.空白溶液；B.样品；C.对照品；1.环氧乙烷；2.二氧六环；3.氯乙醇；4.乙二醇；5.二甘醇Fig.1 GC chromatogramsA.blank；B.sample；C.reference；1.ethylene oxide；2.dioxane；3.ethylene chlorohydrin；4.ethylene glycol；5.diethylene glycol

2.4 线性范围 分别取环氧乙烷、氯乙醇、乙二醇、二甘醇、二氧六环对照品适量，加无水乙醇依次稀释成下列标准溶液：环氧乙烷2.7，5.7，11.1，23.0，44.2，88.4和176.8μg·mL－1；氯乙醇3.4，6.7，14.1，30.2，55.3和167.5μg·mL－1；乙二醇4.7，46.9，93.8，197，422，774和2 345μg·mL－1；二甘醇3.2，6.4，13.5，28.9，53.1和160.8μg·mL－1；二氧六环2.8，5.6，11.8，25.3，46.4和140.7μg·mL－1。取1μL进样分析，以各对照品峰面积积分值Y对进样质量浓度X进行线性回归，计算，结果见表1。结果表明，环氧乙烷质量浓度在2.7～176.8μg·mL－1范围内，氯乙醇质量浓度在3.4～167.5μg·mL－1范围内，乙二醇质量浓度在4.7～2 345μg·mL－1范围内，二甘醇质量浓度在3.2～160.8μg·mL－1的范围内，二氧六环质量浓度在2.8～140.7μg·mL－1范围内线性关系良好。

表1 回归方程与线性范围Tab.1 Linear range and regression equations of calibration curves

2.5 定量限和检测限 取对照品储备液，精密量取不同体积并逐步稀释，按上述方法进样并测定，当所测残留溶剂的信噪比达到要求时，环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇检测限（S／N＝3）分别为0.9×10－4，1.1×10－4，1.2×10－4，0.9×10－4和1.1 ×10－4μg；定量限（S／N＝10）分别为2.7×10－4，2.8 ×10－4，3.4×10－4，2.5×10－4和2.8×10－4μg。

2.6 精密度 取同一对照品溶液，于同1d内按色谱条件连续进样6次，计算峰面积，考察精密度，环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇和二甘醇的RSD分别为1.1%，1.7%，1.9%，1.0%和为0.7%，方法精密度良好。

2.7 加样回收率 精密称取环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇适量，分别加无水乙醇依次稀释成下列溶液：环氧乙烷0.10，0.17和0.23mg·mL－1；氯乙醇0.61，0.76和0.92mg·mL－1；乙二醇2.91，4.84和6.78 mg·mL－1；二甘醇0.23，0.38和0.53mg·mL－1；二氧六环0.61，0.76和0.92mg·mL－1。共制3份。称取聚山梨酯80样品2g，共9份，分3组，分别置于10mL量瓶中，每组分别精密加入上述氯乙醇、乙二醇、二甘醇混合溶液，无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1μL进样分析，计算回收率。环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇的平均回收率分别为105.7%，104.3%，91.3%，105.2%和94.1%；RSD分别为3.7%，2.5%，2.8%，1.4%和3.0%。详见表2。

表2 加样回收率实验结果Tab.2 Results of addition recoveries test

2.8 重复性 分别称取6份聚山梨酯80样品，置于10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1μL进样分析，环氧乙烷、乙二醇、二甘醇的RSD分别为1.1%，1.4%和1.4%，重复性良好；二氧六环和氯乙醇在样品中未检测到。2.9 稳定性 称取4g聚山梨酯80样品，置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。分别在0，2，4，6，8，12和24h精密取1μL，进样分析。环氧乙烷、乙二醇和二甘醇的RSD分别为2.8%，3.5%和3.9%；二氧六环和氯乙醇在样品中未检测到。

2.10 样品测定 按照2.2项下配制样品供试液，每个样品3份分别测定，最终含量取平均值。结果见表3。

表3 聚山梨酯80样品中5种挥发性杂质含量测定结果Tab.3 Results of determination of five volatile impurities in polysorbate 80

3 讨论

《中国药典》（2010年版）中规定，聚山梨酯80中环氧乙烷和二氧六环的限量应分别为小于1ppm和10ppm［10］。根据样品的测定数据，表明样品中均未检测到二氧六环和氯乙醇；仅有1批样品测出含有环氧乙烷，但含量远远超出药典规定的70倍。另外，所有样品中均检测到乙二醇和二甘醇。

从实验结果分析，市场上不同厂家生产的药用级聚山梨酯80的质量差异较大，并有待提高和改善。《中国药典》（2010年版）虽然对聚山梨酯80的相关规定进行了完善，但尚未提出相关条例对乙二醇和二甘醇这2种可能引发不良反应的副产物进行控制，建议增添相应标准对乙二醇和二甘醇的限量进行控制。本研究所建立的方法检测限低，精密度及重复性好，能有效地同时对样品中5种挥发性杂质的残留量进行检测。

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Determination of five volatile impurities in polysorbate 80 by GC

LI Li，WANG Jiayu，GAO Shanshan，HOU Wenzhen，MA Changhua＊（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To establish a method for the determination of five volatile impurities in polysorbate 80.Method The determination was performed on a GsBP－INOWAX column with PEG20000（30m×0.53mm×1.0μm）as solid phase.The column temperatures was 50℃at beginning，and programmed to 200℃at a rate of 5℃·min－1，maintained for 10min；then programmed to 230℃at a rate of 50℃·min－1and held for 20min.The temperatures of the injector and detector were set at 200and 250℃，respectively.Result Five volatile impurities in polysorbate 80were determined simultaneously by gas chromatography.The calibration curves were linear in the ranges of 2.7－176.8μg·mL－1（r＝0.999 8），2.8－140.7μg·mL－1（r＝0.999 8），3.4－167.5μg·mL－1（r＝0.999 9），4.7－2 345μg·mL－1（r＝0.999 8），and 3.2－160.8μg·mL－1（r＝0.999 9）for ethylene oxide，dioxane，ethylene chlorohydrin，ethylene glycol and diethylene glycol，respectively.The average recoveries were 104.3%，91.3%，105.2%，94.1% and 105.7%，RSD were 2.5%，2.8%，1.4%，3.0%and 3.7%，respectively.Conclusion The method were proved to be accurate and sensitive，and can be used for the detection of the volatile impurities in polysorbate 80.

polysorbate 80；volatile impurities；gas chromatography

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.011

R927.2

A

1004－2407（2015）04－0364－04

2015－03－09）

国家自然科学基金项目（编号：81274070）

李莉，女，在读硕士研究生

＊通信作者：马长华，男，教授，硕士生导师