疏肝健脾方醇水双提物对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用

秦秀娟， 高家荣， 姜 辉， 陈金锋， 王 婷， 张 婷

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031）

疏肝健脾方醇水双提物对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用

秦秀娟1， 高家荣2*， 姜 辉2， 陈金锋1， 王 婷1， 张 婷1

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031）

目的探讨疏肝健脾方 （柴胡、黄芪、白芍、白术等）醇水双提物对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的保护作用。方法除正常组外，其余各组采用皮下注射50%四氯化碳，每周2次，持续12周，复制肝纤维化大鼠模型。造模后第7周，分别灌胃给予疏肝健脾方醇水双提物 （1.5、3.0、6.0 g/kg）剂量组和阳性药秋水仙碱组，每天1次，连续6周。实验结束后，Masson染色观察肝脏组织胶原沉积；放射免疫法检测血清中透明质酸 （hya1uronic acid，HA）、层黏蛋白（1aminin，LN）、Ⅲ型前胶原肽（proco11agen-Ⅲ-peptide，PⅢNP）、Ⅳ型胶原（co11agen typeⅣ，Ⅳ-C）的水平；免疫组化染色检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth musc1e actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（co11agen typeⅠ，COL-Ⅰ）的表达。结果与模型组比较，疏肝健脾方醇水双提物不仅可减轻胶原纤维的沉积，改善肝纤维化损伤程度，还可显著降低血清中透明质酸、层粘蛋白、Ⅲ型前胶原肽、Ⅳ型胶原的水平，抑制肝组织中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论疏肝健脾方醇水双提物对化学性肝纤维化大鼠具有很好的抗肝纤维化作用，其可能机制与抑制肝星状细胞活化、减少细胞外基质的合成有关。

疏肝健脾方；肝纤维化；四氯化碳；透明质酸；层粘蛋白；Ⅲ型前胶原肽；Ⅳ型胶原；α-平滑肌肌动蛋白；Ⅰ型胶原；保护作用

肝纤维化以细胞外基质在肝内过度沉积［1］，导致肝内结缔组织异常增生，肝脏结构破坏和肝功能异常为特征，是慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段［2］。疏肝健脾方 （又名肝乐颗粒）是我院特色医院制剂，用于治疗急慢性肝炎、肝纤维化，疗效确切［3-4］。本实验在前期研究的基础上［5］，探讨疏肝健脾方醇水双提物对化学性肝纤维化大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验药物 柴胡 （内蒙）、黄芪 （内蒙）、白芍 （安徽）、白术 （浙江）、茯苓 （安徽）、薏苡仁 （贵州）、猪苓 （山西）、泽兰 （安徽）、板蓝根 （甘肃）、甘草 （新疆）源于安徽中医药大学第一附属医院草药房，经孟楣主任中药师鉴定为正品。疏肝健脾方醇水双提物工艺［6］为精确称取上述药材，第一次加8倍量80%乙醇煎煮1 h，过滤煎液；第二次加8倍量水煎煮1 h，过滤煎液，合并滤液，浓缩成浸膏；秋水仙碱 （西双版纳版纳药业有限责任公司，批号20120125）。

1.2 动物 雄性SD大鼠，SPF级，体质量（200±20）g，购于安徽省实验动物中心，许可证号SCXK（皖）2011-002。

1.3 试剂 四氯化碳 （CC14）（天津市富宇精田化工有限公司）；兔抗大鼠Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体、兔抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）多克隆抗体 （美国Abcam公司）；透明质酸 （HA）、Ⅲ型前胶原氨端肽 （PⅢNP）、层粘连蛋白 （LN）、Ⅳ型胶原 （Ⅳ-C）试剂盒 （北京华英生物技术研究所）。

1.4 仪器 KDC-16H型高速离心机（科大创新股份有限公司）；BS200S型电子天平 （北京赛多利斯天平有限公司）；Mu1tiskan1510型全波段酶标仪（美国热电公司）；Moticam2306型显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）。

2 方法

2.1 模型制备与给药 SD大鼠分为正常组、模型组、疏肝健脾方醇水双提物（1.5 g/kg，3.0 g/kg，6.0 g/kg）组和阳性药秋水仙碱 （1.0×10-4g/kg）组，每组10只。每周一、周四于大鼠背部皮下注射50%CC14（1.0 m L/kg），连续12周，正常组注射等量花生油。造模后第7周，灌胃给予不同剂量疏肝健脾方醇水双提物、秋水仙碱，每天1次，连续6周，正常组、模型组给予等体积生理盐水。

2.2 肝组织肉眼观察 麻醉大鼠，分离肝脏，肉眼观察其色泽、质地、表面光滑度等。

2.3 肝脏组织胶原沉积的检查 摘取相同部位肝脏组织，于10%甲醛溶液中固定，采用Masson染色，光镜下观察胶原在肝脏沉积情况。

2.4 大鼠血清中HA、LN、PⅢNP、IV-C水平的检测 放射免疫法检测血清中HA、LN、PⅢNP、IV-C的水平。

2.5 SP免疫组化测定肝组织中α-SMA、COL-Ⅰ的表达 采用SP法免疫组织化学染色，具体按试剂盒说明书操作，并进行半定量评分。具体方法如下［7］，以阳性细胞百分比结合阳性细胞染色强弱两个方面评分，a为阳性细胞百分比 （0为无阳性细胞，1为阳性细胞占1%～10%，2为11%～50%，3为51%～80%，4为81%～100%）；b为阳性细胞染色强弱 （0为阴性，1为弱阳性，2为中度阳性，3为强阳性），a，b两项乘积即为该例组织的免疫组化评分（IHS，immuno-histochemica1 score）。

2.6 统计学处理 数据输入SPSS 13.0软件进行统计，以表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，以P＜0.05代表有统计学差异。

3 结果

3.1 疏肝健脾方醇水双提物对肝纤维化大鼠肝组织肉眼观察的影响 肉眼观察各组肝脏形态学的变化，正常组大鼠的肝脏呈鲜红色，表面光滑，质地柔软，边缘锐利；模型组大鼠的肝脏呈灰白色，质地变硬，易碎，表面呈颗粒状凸起且无光泽，边缘钝圆；疏肝健脾方醇水双提物各剂量组和秋水仙碱组大鼠的肝脏颜色、质地、表面光滑度较模型组均有所好转。

3.2 疏肝健脾方醇水双提物对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响 Masson染色显示，胶原纤维以蓝染为主。正常组大鼠肝细胞核大、圆，汇管区及小叶间隔有少量胶原纤维沉积，且着色浅、细小；模型组大鼠肝细胞核溶解并消失，大量胶原纤维增生，呈粗大、弥漫型分布，且着色深，并将肝小叶分割成大小不等的假小叶；给予疏肝健脾方醇水双提物和秋水仙碱灌胃后，各给药组胶原纤维沉积均减少，且着色变浅，假小叶形成减少，肝纤维化程度均有所改善，结果见图1。

图1 疏肝健脾方醇水双提物对化学性肝纤维化大鼠肝病理组织学的影响 （×200）Fig.1 Effects of ethanolic and aqueous extractsof Shugan Jianpi Formula on the pathological changes of rat liver fibrosis（×200）

3.3 疏肝健脾方醇水双提物对化学性肝纤维化大鼠肝纤四项的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中肝纤四项的水平均显著升高；与模型组比较，疏肝健脾方醇水双提物中、高剂量组可显著降低HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的水平，低剂量组虽能降低大鼠血清中HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的水平，但无统计学意义，结果见表1。

3.4 疏肝健脾方醇水双提物对肝纤维化大鼠肝脏中α-SMA、COL-Ⅰ表达的影响 α-SMA、COL-Ⅰ免疫组化染色以棕黄色或深棕黄色为阳性表达，α-SMA广泛分布于汇管区、纤维间隔内；COL-Ⅰ主要表达于中央静脉、汇管区内。光镜下可见，α-SMA、COL-Ⅰ在正常组呈低表达，模型组中α-SMA、COL-Ⅰ的表达显著升高，疏肝健脾方醇水双提物中、高剂量组α-SAM、COL-Ⅰ的表达显著降低，低剂量组虽能一定程度抑制α-SMA、COL-Ⅰ的表达，但与模型组相比，不具有统计学意义，结果见图2～3，IHS评分见表2。

表1 疏肝健脾方醇水双提物对HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的影响（，n=10）Tab.1 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on HA，LN，PⅢNP andⅣ-C of rat liver fibrosis（，n=10）

表1 疏肝健脾方醇水双提物对HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的影响（，n=10）Tab.1 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on HA，LN，PⅢNP andⅣ-C of rat liver fibrosis（，n=10）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

组别 剂量/（g·kg-1） HA/（μg·L-1） LN/（μg·L-1） PⅢNP/（μg·L-1） Ⅳ-C/（μg·L-1）106.94±21.18 58.39±11.79 94.36±12.37 24.70±6.30模型组 - 209.99±28.78## 103.39±19.68## 148.40±27.19## 47.80±10.66##疏肝健脾方醇水双提物 1.5 199.62±29.82 94.30±13.82 128.19±26.80 41.98±11.03疏肝健脾方醇水双提物 3.0 184.93±21.68* 89.96±16.05* 121.68±21.97* 39.60±7.23*疏肝健脾方醇水双提物 6.0 175.97±27.04** 85.28±13.64** 111.91±18.87** 36.81±6.69**秋水仙碱组 1.0×10-4 177.75±28.68** 88.87±14.38* 120.36±25.62** 38.69±9.69正常组-**

图2 疏肝健脾方醇水双提物对肝纤维化大鼠肝脏中α-SMA改变的影响 （×200）Fig.2 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on theα-SMA of rat liver fibrosis（×200）

图3 疏肝健脾方醇水双提物对肝纤维化大鼠肝脏中COL-Ⅰ改变的影响 （×200）Fig.3 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on COL-Ⅰin rat liver fibrosis（×200）

表2 疏肝健脾方醇水双提物对α-SMA、COL-Ⅰ表达的IHS评分影响 （，n=8）Tab.2 E ffects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on IHS score ofα-SMA、COL-Ⅰexpression in rat liver fibrosis（，n=8）

表2 疏肝健脾方醇水双提物对α-SMA、COL-Ⅰ表达的IHS评分影响 （，n=8）Tab.2 E ffects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on IHS score ofα-SMA、COL-Ⅰexpression in rat liver fibrosis（，n=8）

组别 剂量/（g·kg-1）α-SMA（IHS）COL-Ⅰ（IHS）正常组- 2.75±1.16 2.25±1.28模型组 - 8.38±1.06##7.38±1.85##疏肝健脾方醇水双提物组 1.5 6.88±1.96 6.38±1.85疏肝健脾方醇水双提物组 3.0 4.88±2.03**5.38±1.68*疏肝健脾方醇水双提物组 6.0 4.25±1.16**4.75±1.75**秋水仙碱组 1.0×10-4 5.5±2.39**5.25±2.19*

4 讨论

肝纤维化是不同损伤因素引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应，肝星状细胞（hepatic ste11ate ce11）活化为其核心事件，是一切慢性肝病的共同病理学基础，已成为严重危害人类健康的世界性问题［8-10］。

疏肝健脾方以 “见肝知脾，知肝传脾，当先实脾”理论制成的特色院内制剂［11］，具有疏肝解郁、健脾渗湿、活血化瘀的功效，主治急慢性肝炎，肝炎病毒携带者，肝纤维化，肝硬化活动期。临床应用十余年，疗效确切。本研究发现，CC14诱导的模型组大鼠肝脏有大量胶原纤维沉积，并将肝小叶分割成大小不等的假小叶，表明肝纤维化模型复制成功。疏肝健脾方醇水双提物干预后，肝组织病理学损伤程度明显减轻，提示对化学性肝纤维化有很好的保护作用。

研究发现，HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C的水平与肝纤维化的程度呈正相关，是肝纤维化重要的血清学指标［12］。HA由细胞间质合成，血清中HA的含量变化可以敏感的反应出肝纤维化的程度；LN是基底膜透明层的结构蛋白，肝纤维化形成时，HSC分泌大量LN，与Ⅳ-C形成肝窦毛细血管化，LN随着肝纤维化的形成而增多，是反映肝纤维化增生的标志物［13］；PⅢNP是血液中经内肽酶水解切下的氨基端，在形态学观察到纤维增生之前，PⅢNP的含量就已经升高，因此，PⅢNP能早期特异性地反映肝纤维化的形成［14］。本实验研究显示，与正常组比较，模型组大鼠血清中HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C水平明显升高；疏肝健脾方醇水双提物干预后，可降低HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C的水平。

α-SMA是公认的肝星状细胞（HSC）活化标志物，在正常组织中，α-SMA仅在血管壁平滑肌中表达；在肝纤维化中，α-SMA可广泛表达于汇管区、纤维间隔和门静脉［15］。α-SMA表达增加，表明HSC活化增加［16］。当HSC被激活后，可分泌大量的ECM，ECM主要成分包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原，其中Ⅰ型胶原是肝纤维间隔的重要来源，Ⅰ型胶原的表达随着肝纤维化的发展而增多［17］。本实验研究显示，模型组大鼠肝脏内的α-SMA、COL-Ⅰ表达升高；疏肝健脾方醇水双提物灌胃后，可抑制α-SMA、COL-Ⅰ的表达。

综上，疏肝健脾方醇水双提物对化学性肝纤维化大鼠具有很好的抗肝纤维化作用，其可能机制与抑制HSC活化、减少ECM的合成有关。

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Protective effects of ethanolic and aqueous extract of Shugan Jianpi Formula on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats

QIN Xiu-juan1， GAO Jia-rong2*， JIANG Hui2， CHEN Jin-feng1， WANG Ting1， ZHANG Ting1

（1.AnhuiUniversityofChineseMedieine，Hefei230038，China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine，Grade3Labora-toryofTraditionalChineseMedicinePreparation，StateAdministrationofTCM，Hefei230031，China）

ABSTRACT：AIMTo exp1ore the protective effects of ethano1ic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formu1a（BupleuriRadix，AstragaliRadix，Paeoniae Radix alba，AtractylodismacrocephalaeRhizoma，etc.）on CC14-induced hepatic fibrosis in rats.METHODSRats with 1iver fibrosis weremode1ed by the injection of 50%CC14twice a week for twe1ve weeks except the contro1group.Ethano1ic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formu1a（1.5 g/kg，3.0 g/kg，6.0 g/kg）and co1chicine were used dai1y via 1avage in the 7th week for six weeks.Co11agen fibers depositions of hepatic tissueswere observed by Masson staining.The contents of HA（hya1uronic acid），LN（1aminin），PⅢNP（proco11agen-Ⅲ-peptide）andⅣ-C（co11agen typeⅣ）in serum were tested by the radioimmunoassaymethod.The expressions ofα-SMA（α-smooth musc1e actin），COL-Ⅰ（co11agen typeⅠ）were detected by immunohistochemica1.RESULTSCompared with the mode1 group，ethano1ic and aqueous extracts cou1d not on1y a11eviate the co11agen fibers deposition，significant1y decrease the contents of HA，LN，PⅢNP andⅣ-C in serum，but a1so inhibit the expressions ofα-SMA，COL-Ⅰin ratswith 1iver fibrosis.CONCLUSIONEthano1ic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formu1a havemarked effects on hepatic fibrosis and itsmechanism is possib1y re1ated to the inhibition of hepatic ste11ate ce11s and the decrease in synthesis of extrace11u1armatrix.

Shugan Jianpi Formu1a；hepatic fibrosis；CC14；hya1uronic acid（HA）；1aminin（LN）；proco1-1agen-Ⅲ-peptide（PⅢNP）；co11agen typeⅣ（Ⅳ-C）；α-smooth musc1e actin（α-SMA）；co11agen typeⅠ（COL-Ⅰ）；protective effect

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1646-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.003

2014-12-02

国家自然科学基金青年项目 （81102874）

秦秀娟 （1990—），女，硕士，研究方向为中药药理。Te1：（0551）62838553，E-mai1：1036951872@qq.com

*通信作者：高家荣（1964—），男，主任药师，研究方向为中药制剂开发。Te1：（0551）62838556，E-mai1：zyfygjr2006@163.com