淡豆豉和黑豆乙醇提取物的促成骨细胞增殖活性及HPLC-MS分析

冯 薇， 孙佳明， 李 琛， 牛丽颖， 刘 姣， 张 凯， 王鑫国*

（1.河北中医学院中药药理实验室，河北石家庄050200；2.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117）

淡豆豉和黑豆乙醇提取物的促成骨细胞增殖活性及HPLC-MS分析

冯 薇1， 孙佳明2， 李 琛1， 牛丽颖1， 刘 姣1， 张 凯1， 王鑫国1*

（1.河北中医学院中药药理实验室，河北石家庄050200；2.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117）

目的比较分析淡豆豉和黑豆乙醇提取物促大鼠颅骨成骨细胞增殖活性及二者的化学成分。方法采用MTT法对淡豆豉和黑豆的乙醇提取物进行促大鼠颅骨成骨细胞增殖活性的研究，并通过高效液相色谱-质谱联用技术对二者化学成分进行比较分析。结果淡豆豉和黑豆的乙醇提取物对大鼠成骨细胞的促增殖率分别可达到36.5%和28.2%，其主要有效成分为异黄酮类化合物，经液质联用分析共鉴定出15个黄酮类成分。结论黑豆发酵成淡豆豉后的成分变化主要体现在由苷类成分脱糖转化为苷元，含有量显著增加的大豆苷元和染料木素两种苷元主要由丙二酰大豆苷 （大豆苷元-G-M）和丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）脱丙二酰基和葡萄糖转化而来。

淡豆豉；黑豆；黄酮类成分；大鼠颅骨成骨细胞；液质联用

淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum）是由豆科植物大豆［Glycinemax（L.）Merr.］的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成的制品，是我国特有的经固态发酵制备的中药之一，具有解表除烦，宣发郁热等功效［1］。作为发酵淡豆豉的主要原料，黑豆（Sojae Semen Nigrum）［2］也是一味应用广泛的药食两用中药，其性味甘平，可益精明目，养血祛风，用于阴虚烦渴，手足麻木等症［1］324。发酵炮制过程使黑豆和淡豆豉具备了不同的药性药效。

课题组前期实验发现，淡豆豉能够纠正骨质疏松大鼠骨组织形态计量学参数的异常，改善骨微细结构及骨生物力学性能，提高骨质量［3-4］，但未对淡豆豉和原料黑豆的促成骨细胞增殖活性及其化学成分进行深入分析研究。为进一步研究淡豆豉乙醇提取物改善骨质疏松的物质基础，本研究以黑豆及其发酵制备的淡豆豉乙醇提取物为研究对象，以体外大鼠成骨细胞增殖率为指标，研究其体外促成骨细胞增殖活性。再应用HPLC-DAD-ESI-MS/MS比较分析淡豆豉和原料黑豆乙醇提取物成分，明确发酵后药性变化的物质基础以及淡豆豉和黑豆乙醇提取物促成骨细胞增殖的活性成分。

1 材料

1.1 材料 淡豆豉为实验室参照文献［2］发酵制备，原料黑豆、青蒿和桑叶等均购于河北安国。

1.2 动物 出生24 h以内SD大鼠，购自河北省实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（冀）2008-1-003，合格证号1112001。

1.3 试剂与仪器 Agi1ent 1100 series LC-MSD液质联用仪，包括Agi1ent SL型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器（DAD）、自动进样、柱温箱、Chemistation化学工作站等；BP211D型十万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；KHB ST-360酶标分析仪（上海科华生物工程股份有限公司）；MCO-15AC CO2培养箱（日本三洋）；Motic AE倒置显微镜（麦克奥迪）；96微孔板，培养瓶，各型号移液枪及枪头等。染料木苷对照品 （中国食品药品检定研究院，批号111709-200501，纯度≥98%）、大豆苷对照品 （中国食品药品检定研究院，批号111738-200501，纯度≥98%）、染料木素对照品 （中国食品药品检定研究院，批号111704-200501，纯度≥98%）、大豆苷元对照品 （成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-10110301，纯度≥98%）、黄豆黄素对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-10092501，纯度≥98%）、黄豆黄苷对照品 （中国食品药品检定研究院，批号111756-200501，纯度≥98%）。低糖DMEM（Gibco）；胎牛血清（Hyc1one）；胰蛋白酶；MTT（Am resco）；胶原酶Ⅱ（Invitrogen）；其余试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

2 方法与结果

2.1 淡豆豉和黑豆提取物的制备 取实验室发酵制备的淡豆豉样品，粉碎 （过20目筛），取粗粉500 g，先用石油醚浸泡后渗滤提取至提取液颜色浅，回收石油醚，残渣挥去石油醚，用70%乙醇浸泡渗滤提取至颜色浅，合并提取液，减压蒸干，即为淡豆豉乙醇提取物。取发酵制备淡豆豉的同批原料黑豆，依同法制备，即得黑豆乙醇提取物。

2.2 淡豆豉和黑豆乙醇提取物促成骨细胞增殖活性的测定

2.2.1 大鼠成骨细胞的分离、培养及鉴定 参照文献［5］，采用改良组织块法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养液 （青霉素1×105U/L、链霉素1×105U/L，pH 7.2～7.4）进行传代，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞传至第5代，通过细胞形态学观察及碱性磷酸酶染色鉴定，5～6代细胞用于实验。

2.2.2 成骨细胞增殖能力测定（MTT） 实验分为空白对照组及6个不同浓度提取物组。细胞传至第5代，调整细胞密度为5×107/L，接种至96孔培养板，药物干预，于72 h吸除培养液，每孔加入100μL无血清DMEM培养液，20μL MTT（5 g/L），继续孵育4 h，吸弃培养基上清，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪在492 nm处检测OD值。细胞增殖率计算公式如下。

细胞增殖率=［（干预组OD值-对照组OD值）/对照组OD值］×100%

与空白对照组相比，淡豆豉提取物在质量浓度为1×10-8～1×10-3g/L时处理72 h，均显著促进成骨细胞增殖 （P＜0.01或P＜0.05）；黑豆提取物在质量浓度为1×10-8g/L时处理72 h，与空白对照组细胞增殖情况无显著性差异 （P＞0.05），其他质量浓度显著促进成骨细胞增殖 （P＜0.01）（见表1）。

表1 不同质量浓度淡豆豉和黑豆乙醇提取物对大鼠成骨细胞增殖的影响 （，n=6）Tab.1 Effects of different concentrations of ethanolic extracts of black and ferm ented soybean on the proliferation of rat osteoblasts（，n=6）

表1 不同质量浓度淡豆豉和黑豆乙醇提取物对大鼠成骨细胞增殖的影响 （，n=6）Tab.1 Effects of different concentrations of ethanolic extracts of black and ferm ented soybean on the proliferation of rat osteoblasts（，n=6）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

0.300±0.010 0.300±0.010 1×10-8g/L 0.318±0.011* 0.317±0.010 1×10-7g/L 0.330±0.010** 0.332±0.009**1×10-6g/L 0.375±0.013** 0.354±0.016**1×10-5g/L 0.394±0.021** 0.385±0.016**1×10-4g/L 0.409±0.015** 0.383±0.018**1×10-3g/L 0.394±0.009** 0.375±0.020淡豆豉 黑豆空白对照组组别 OD值**

实验结果 （见图1～2）表明，黑豆和淡豆豉乙醇提取物具有较明显的促成骨细胞增殖作用，且其会随着提取物质量浓度的增大而增大，当达到一定质量浓度时，样品对成骨细胞的增殖作用有所下降，其中以淡豆豉乙醇提取物促增殖效果最为明显，当提取物为1×10-4g/L时效果最佳，增殖率达36.5%。在同等质量浓度下，淡豆豉乙醇提取物对成骨细胞促增殖作用略高于黑豆，黑豆则在1 ×10-5g/L时增殖率可达到28.2%。

图1 黑豆乙醇提取物对成骨细胞促增殖作用Fig.1 Proliferation of ethanolic extract from black soybean

2.3 淡豆豉和黑豆乙醇提取物成分分析

2.3.1 HPLC-MS实验条件 Agi1ent Ec1ipse P1us-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，二元线性梯度洗脱，流动相梯度为0～10 min，13%A，87%B；10～40 min，25%A，75%B；40～55 min，30%A，70% B；55～80 min，80%A，20%B；体积流量0.6 mL/min；检测波长261 nm；柱温25℃；进样量30μL；电离源为电喷雾离子源 （ESI）；正离子方式检测；扫描范围为m/z50～1 400；干燥气温度350℃；干燥气体积流量9.0 L/min；雾化气压强为0.24 MPa（35.0 psi）；毛细管电压4 kV。

图2 淡豆豉乙醇提取物对成骨细胞促增殖作用Fig.2 Proliferation of ethanolic extract from fermented soybean

2.3.2 乙醇提取物成分分析 取 “2.1”项中淡豆豉和黑豆乙醇提取物各0.5 mg，分别溶解于10.0 m L甲醇，过0.45μm微孔滤膜，经HPLCESI-MS/MS分析，得质谱总离子流图（见图3）。

图3 淡豆豉提取物的总离子流图 （A）和液相色谱图（B）；黑豆乙醇提取物的总离子流图 （C）和液相色谱图 （D）Fig.3 Total ion chromatogram s and HPLC chromatograms of fermented soybean（A and B）and black soybean extract（C and D）

依据各色谱峰的分子离子峰及主要碎片峰的解析，与文献［6-8］和对照品对比，确定了淡豆豉和黑豆乙醇提取物中15个黄酮类成分，其中化合物1、4首次在淡豆豉中发现，结果见表2。

3 讨论

淡豆豉乙醇提取物的促成骨细胞增殖率较黑豆乙醇提取物有一定程度的提高，二者在一定质量浓度范围随剂量增加表现出对大鼠颅骨成骨细胞的促生殖作用增强，达到一定质量浓度后，增殖率有所下降。从液质成分分析结果 （见表3）可以看出，黑豆发酵为淡豆豉后成分变化主要体现在由苷类成分脱糖转化为苷元，提示异黄酮苷元的促成骨细胞增殖活性可能强于苷。

表2 淡豆豉和黑豆提取物的LC-MS/MS分析Tab.2 LC-MS/MS analysis of the extract from fermented soybean and black soybean

对黑豆和淡豆豉提取物中峰面积大于色谱峰总峰面积10%的主要成分峰面积进行分析 （见表3），淡豆豉提取物中含有量较高的成分分别为大豆苷元、染料木素2种异黄酮苷元及其及苷类成分，由此可见其主要有效成分为异黄酮类化合物。4种含有量较高的苷中，大豆苷和染料木苷发酵后峰面积变化不大，稍有降低趋势，而丙二酰大豆苷（大豆苷元-G-M）和丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）均在发酵后色谱峰面积减少为发酵前的1/40左右，相应的两种苷元大豆苷元和染料木素均在发酵后色谱峰面积增加为发酵前的30倍左右 （见表3）。因此含有量显著增加的大豆苷元和染料木素两种苷元主要由丙二酰大豆苷 （大豆苷元-G-M）和丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）脱丙二酰基和葡萄糖转化而来。

表3 黑豆和淡豆豉提取物中色谱峰峰面积Tab.3 Peak areas of black and fermented soybean extracts

化合物1、4在黑豆中未检出，可能由丙二酰黄豆黄苷 （黄豆黄素-G-M）、丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）或乙酰染料木苷（染料木素-G-A）发酵过程中脱丙二酰基或乙酰基得到。化合物5、7、11在淡豆豉中未检出，可能由于3个化合物在黑豆中含有量不高，发酵过程使其脱掉一定基团而使含有量进一步降低而未检出。

准分子离子 ［M+H］+碰撞裂解时丢失所含糖基和其他配基 （乙酰基或丙二酰基）的碎片以及苷元准分子离子都具有较高丰度，可获得被测黄酮苷的相对分子质量、苷元、配糖基等化学结构信息。但是分析结果中存在4对同分异构体，1号与6号、3号与4号可以借助染料木苷和黄豆黄苷对照品进行区分。5号与8号、9号与11号化合物不能区分，区分黄酮苷同分异构体还需要借助相应对照品或色谱分离工作。

在淡豆豉成分分析中并未检出青蒿和桑叶中的相应成分，可能由于传统的淡豆豉自然发酵工艺中，作为辅料的青蒿和桑叶用量少 （黑豆 ∶青蒿∶桑叶=10∶1∶1）。同时，在黑豆吸胀过程中能渗入黑豆种皮的青蒿桑叶成分极为有限，大部分辅料水煎提取物及药渣在二次发酵前的净制工序中被洗净除去［1］。因此我们认为青蒿桑叶转移入淡豆豉中的成分较少，导致淡豆豉中相关辅料成分含量过低未能检出。

目前国内外对治疗骨质疏松植物药的研究发现，异黄酮类成分能够通过不同的转导途径促进成骨细胞生成，抑制破骨细胞分化，从而减少骨质丢失，提高骨密度。其中染料木素可有效改善疏松骨质的骨密度，阻止甲状旁腺诱导的骨吸收。而大豆苷元对于松骨质和密骨质的骨密度提高均有作用［9-12］。本研究显示淡豆豉和黑豆中的异黄酮类成分是促成骨细胞增殖活性的物质基础，黑豆、淡豆豉化学成分含有量存在差异可能是其功效差异的主要原因，淡豆豉和黑豆的成分与活性上的差异也为阐释淡豆豉的发酵机制和进一步研究两者的药效差异提供参考。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：308.

［2］中华人民共和国卫生部药政管理局.中药炮制规范［S］.北京：人民卫生出版社，1988：192.

［3］牛丽颖，王鑫国，任艳青，等.淡豆豉提取物对去卵巢骨质疏松大鼠骨微细结构的改善作用［J］.中成药，2010，32（11）：1874-1876.

［4］李 双，牛丽颖，窦玉红，等.淡豆豉对去卵巢骨质疏松大鼠骨生物力学性能的影响［J］.中药药理与临床，2008，24（2）：57-58.

［5］王建华，张军芳，吕 萍，等.异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究［J］.天然产物研究与开发，2010，22（3）：403-407.

［6］Diandian S，Qing1i W，Wi11ian J S，et al.Chromatographic fngerprints and quantitative ana1ysis of isof1avones in Tofu-type soybeans［J］.Bone，2012，130（2）：1003-1009.

［7］方 高，张 鹏，叶晓岚，等.淡豆豉异黄酮苷及其苷元的电喷雾离子阱质谱分析［J］.第二军医大学学报，2013，34（10）：1108-1115.

［8］陈 岑，宋粉云，范国荣，等.ASE-HPLC-ESI-IT/MS法分析淡豆豉中大豆异黄酮类化合物［J］.广东药学院学报，2014，30（2）：164-167.

［9］方玲娜，戴如春，廖二元.异黄酮与骨质疏松［J］.国际病理科学与临床杂志，2006，26（1）：72-74.

［10］Fonseca D，Ward W E.Daidzein together with high ca1cium preserve bonemassand biomechanica1strength atmu1tip1e sites in ovariectomized mice［J］.Bone，2004，35（2）：489-497.

［11］Miksicek R J.Interaction ofnatura11y occurring nonsteroida1estrogens with expressed recombinant human estrogen receptor［J］.JSteroid Biochem Mol Biol，1994，49（2）：153-160.

［12］Garcia Pa1acios V，Robinson L J，Borysenko CW，et al.Negative regu1ation ofRANKL-induced osteoc1astic differentiation in RAW264.7 ce11s by estrogen and phytoestrogens［J］.J Biol Chem，2005，280（14）：13720-13727.

Proliferative activity of ethanolic extract from black and fermented soybean on rat osteoblasts and HPLC-MS analysis

FENGWei1， SUN Jia-ming2， LIChen1， NIU Li-ying1， LIU Jiao1， ZHANG Kai1，WANG Xin-guo1*

（1.Pharmacology Laboratory of Chinese Medicine，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China；2.Development Center of Traditional Chinese Medicine and Bioengineering，Changchun University of ChineseMedicine，Changchun 130117，China）

AIMTo investigate the pro1iferative activity of ethano1ic extract from b1ack soybean（Sojae Semen Nigrum）and fermented soybean（Sojae Semen Praeparatum）on rat osteob1asts and HPLC-DAD-ESI-MS/MS ana1ysis.METHODSThe pro1iferation test was performed by using rat osteob1asts with MTT assays in vitro. Qua1itative ana1ysiswas performed by HPLC-DAD-MS to ana1yze and comparemajor active components in both a1-coho1ic extracts.RESULTSEthano1ic extracts of b1ack and fermented soybean were demonstrated to show pro1iferative activity.Fifteen f1avonoids were tentative1y characterized based on UV and mass spectra1 ana1ysis.CONCLUSIONThe experimenta1data show thatwhen b1ack soybean ferments into fermented soybean，heterosides un-dergoes the desugarization and converts into ag1ycon，which increases the contents of daidein and genistein by means of the dema1ony and deg1ucose ofma1ony1daidzin and ma1ony1genistin.

fermented soybean（Semen Sojae Praeparatum）；b1ack soybean（Sojae Semen Nigrum）；f1avonoid；rat osteob1asts；HPLC-MS

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1651-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.004

2014-11-25

河北省自然基金面上项目 （H2012206019，H2014206302）；河北省教育厅青年基金 （2011178）

冯 薇 （1982—），女，博士，讲师，研究方向为中药药效物质基础研究。Te1：（0311）85216828，E-mai1：rainbow10571@ 126.com

*通信作者：王鑫国，男，教授，硕士生导师，研究方向为中药质量评价与新药开发。Te1：（0311）89926208，E-mai1：wangxinguozy@ 126.com