枫香脂挥发油对大鼠离体胸主动脉的舒张作用

李建明， 王 政，陈 川*， 宋清宏

（1.上海市中医老年医学研究所，上海200031；2.上海中医药大学中药学院，上海201203）

枫香脂挥发油对大鼠离体胸主动脉的舒张作用

李建明1， 王 政2，陈 川1*， 宋清宏1

（1.上海市中医老年医学研究所，上海200031；2.上海中医药大学中药学院，上海201203）

目的研究水蒸汽蒸馏法提取枫香脂挥发油对大鼠离体胸主动脉的舒张作用，并探讨其可能机制。方法枫香脂挥发油成分分析在气相-质谱上进行，分离SD大鼠胸主动脉进行离体血管环实验，观察枫香脂挥发油对苯肾上腺素预收缩引起的舒缩功能的反应，并结合一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯和环氧合酶抑制剂吲哚美辛，观测枫香脂挥发油对血管环的作用。结果气相-质谱结果显示主要成分是三甲基肼、3-蒈烯、（1R）-2，6，6-三甲基二环［3.1.1］庚-2-烯、2-亚甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基-二环 ［5.2.0］壬烷；累计体积分数的枫香脂挥发油对苯肾上腺素预收缩的血管环在内皮完整最大舒张率可达32.67%；结合左旋硝基精氨酸甲酯和吲哚美辛孵育0.5 h后，均显示有明显抑制血管舒张的作用。结论枫香脂挥发油对大鼠离体血管确实有舒张血管的作用，其机制可能跟一氧化氮合酶和环氧合酶的合成有关。

枫香脂；挥发油；气相-质谱；血管环实验；左旋硝基精氨酸甲酯；吲哚美辛

枫香脂为金缕梅科植物枫香［1-3］Liquidambar formosana Hance的干燥树脂，枫香脂［4］性辛、微苦，平，归肺、脾经，具有活血止痛、解毒、生肌的功效，用于跌扑损伤、痈疽肿痛、吐血、衄血等。关于枫香脂挥发性成分的研究已有一些报道，多用水蒸气蒸馏法［5-6］提取其挥发性成分，对样品的处理采取液-液萃取 （如用石油醚萃取蒸馏出的油等）。虽挥发油提取已有研究，但是其成分和药理活性很少有报道。血管内皮功能［7］包括血管收缩舒张功能和内皮细胞分泌功能。血管的收缩舒张功能［8-10］是通过血管内皮细胞合成和分泌许多血管活性物质 （如内皮衍生舒张因子、内皮素等）实现的。针对此种情况，本研究主要结合舒张血管的不同抑制剂，研究枫香脂挥发油舒张血管的可能机制。

1 实验方法

1.1 试剂与仪器 新鲜枫香脂购自云南省文山州。乙酰胆碱（ACh）（批号A2661-25G，Sigma）；苯肾上腺素（pheny1ephrine，PE）（批号P6126-5G）；五羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（批号H9523-25MG，Sigma）；左旋硝基精氨酸甲酯 （LNAME）（批号561334A；Sigma）；吲哚美辛（indomethacin）（批号51298-62-5，Adamas Reagent）。PawerLab血管功能测定系统（澳大利亚AD INSTRUMENTS）；4通道（6 m L水浴槽）多功能生理记录仪（澳大利亚AD INSTRUMENTS）；气相色谱仪（Agi1ent，GC6890N）；色谱柱（Agi1ent，HP-5）；二苯基聚硅氧烷共聚物色谱柱，顶空进样皿（Agi1ent，7694E）；美国Agi1ent 7890A、5975C型气相色谱-质谱联用仪。

1.2 动物 SD大鼠，普通级，（200±20）g，雄性，合格证号SCXK 2012-0002，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心。

1.3 枫香脂挥发油的提取 取一定量新鲜枫香脂，加5倍量水，水蒸汽提取8 h，将收集得到的枫香脂挥发油离心去水，量取体积，精确到0.1 mL，气相-质谱测定成分。动物实验时，挥发油使用二甲亚砜（DMSO）溶解。

1.4 血管环的制备 大鼠麻醉处死，迅速取出整体胸主动脉部位，置于4℃、含95%O2和5%CO2混合气体预饱和的K-H液中，分离胸动脉剔除周围脂肪组织制成3～5 mm血管环，将血管环固定于6 mL K-H液的浴槽内，37℃恒温，并持续通入95%O2+5%CO2的混合气体。每个血管环给予2.0 g拉力，每20 min更换K-H液1次，平衡80 min，以60 mmo1/L的KC1预收缩两次，以诱发最大收缩度，用K-H液洗脱拉力稳定后，第一次加入五羟色胺20μmo1/L，待拉力达到坪值后加入10μmo1/L ACh，若血管舒张达80%以上，可认为内皮完整。内皮检查完整度后，使用K-H液洗脱拉力稳定，第二次使用10μmo1/L苯肾上腺素PE，待拉力稳定后加入目标药物，检测药物对血管环的作用（枫香脂挥发油体积分数均为0.75 mL/m L）。

1.5 观察累计剂量的枫香脂挥发油对基础状态血管环的影响 将内皮完整的SD大鼠胸主动脉血管环随机分为枫香脂挥发油组、对照组。以不同累计剂量作用于基础状态，实验组 （n=6）与对照组（n=6）采用累计剂量使其终体积分数达到2.5× 10-7、5×10-7、1.0×10-6、2.0×10-6mL/mL，每一分钟加一次，对照组以相应的DMSO溶解的K-H液代替挥发油加入量。

1.6 累计剂量枫香脂挥发油对PE预收缩内皮完整的影响 分组及加药方法同 “1.5”项，实验组（n=6）以不同累计剂量枫香脂挥发油作用于10 μmo1/L苯肾上腺素PE预收缩的血管环，观察枫香脂挥发油对血管环的影响；对照组加入DMSO溶解的K-H液代替挥发油。

1.7 枫香脂挥发油对无钙液预处理的的去内皮血管环的作用 实验组 （n=6）将血管使用机械力取出血管内皮细胞，然后在无钙液中稳定40 min，加入枫香脂挥发油终体积分数为 2.0×10-6m L/mL，共孵育30 min，加入10μmo1/L苯肾上腺素PE预收缩的血管环，观察枫香脂挥发油的作用；对照组加入含有DMSO溶解的K-H液代替挥发油。

1.8 观察枫香脂挥发油对一氧化氮合酶抑制剂LNAME预处理的PE预收缩的影响 实验组（n= 6）用L-ANME（浓度为0.1 mmo1/L）孵育内皮完整的血管环20 min，以PE预收缩，观察枫香脂挥发油的作用；对照组加入含有DMSO溶解的K-H液代替挥发油。

1.9 观察枫香脂挥发油对环氧合酶抑制剂吲哚美辛预处理的PE预收缩的影响 实验组 （n=6）用吲哚美辛（浓度为0.1 mmo1/L）孵育内皮完整的血管环20 min，以PE预收缩，观察枫香脂挥发油的作用；对照组加入含有DMSO溶解的K-H液代替挥发油。

2 结果

2.1 枫香脂挥发油气相-质谱（GC-MS）分析 根据前期实验研究和文献［2-3］调查确定，气相色谱条件为HP-5MS毛细管柱（30 m×250μm×0.25 μm）；柱温，起始柱温100℃，然后以6℃/min升温，至160℃时保留2 min，以2℃/min升温，至190℃时保留3 min，以8℃/min升温至240℃；进样器温度，310℃；载气，He；分流比，2∶1；进样量，1μL。质谱条件EI离子源；温度280℃；电离电压70 eV；扫描质量范围，50.0～500 amu（m/z）；NIST05a谱库，如图1和表1。

图1 枫香脂挥发油气相-质谱离子峰Fig.1 GC-M S of volatile oil from Liquidambaris Resina

表1 枫香脂挥发油主要成分Tab.1 M ain components of volatile oil from Liquidambaris Resina

2.2 累计剂量的枫香脂挥发油对基础状态血管环的影响 以不同累计剂量作用于基础状态，实验组（n=6）与对照组 （n=6）采用累计剂量使其终体积分数达到 2.5×10-7、5×10-7、1.0×10-6、2.0×10-6mL/mL。最终结果显示，累计剂量的枫香脂对基础状态的血管环无影响。

2.3 累计剂量枫香脂挥发油对PE预收缩内皮完整的影响 实验组 （n=6）以不同累计剂量枫香脂挥发油作用于10μmo1/L苯肾上腺素PE预收缩的血管环，以PE最大收缩度作为100%对照参考。结果显示，不同累计体积分数的枫香脂挥发油对血管环有舒张作用，并且有体积分数依耐性舒张，在终剂量达到2.0×10-6m L/mL时，舒张最大，达到32.67%，如图2。

图2 累计剂量枫香脂挥发油对PE预收缩内皮完整的影响Fig.2 Effect of cumulative dose of Liquidambaris Resina volatile oil on PE pre-contracted artery rings

2.4 枫香脂挥发油对无钙液预处理的的去内皮血管环的作用 无钙液中稳定40min，加入枫香脂挥发油终体积分数为2.0×10-6m L/mL，共孵育30 min，孵育前用PE预收缩一次，孵育后PE预收缩一次，比较前后两次收缩程度，以第二次收缩占第一次收缩程度百分率判断。与空白组比较发现，无统计学意义，证明枫香脂挥发油舒张血管与血管内皮细胞释放钙离子无关，如图3。

2.5 枫香脂挥发油对一氧化氮合酶抑制剂LNAME预处理的PE预收缩的影响 实验组（n= 6）用L-ANME（浓度为0.1 mmo1/L）孵育内皮完整的血管环20 min，PE预收缩，以PE最大收缩度作为100%对照参考。观察发现枫香脂挥发油相比于不加一氧化氮合酶抑制剂L-NAME，有明显的抑制舒张的作用，如图4。

2.6 枫香脂挥发油对环氧合酶抑制剂吲哚美辛预处理的PE预收缩的影响 实验组（n=6）用环氧合酶抑制剂吲哚美辛（浓度为0.1 mmo1/L）孵育内皮完整的血管环20 min，PE预收缩，以PE最大收缩度作为100%对照参考。观察发现枫香脂挥发油相比于不加环氧合酶抑制剂吲哚美辛，有明显的抑制舒张的作用，如图5。

3 结论

图3 枫香脂挥发油对无钙液预处理的的去内皮血管环的作用Fig.3 Effect of Liquidambaris Resina volatile oil on vascular ringsw ithout endothelium pretreated by calcium-free solution.

图4 枫香脂挥发油对一氧化氮合酶抑制剂L-NAME预处理的PE预收缩的影响Fig.4 E ffect of Liquidambaris Resina volatile oil on PE p re-contraction pretreated by L-NAM E

经前期实验工艺［3］，本课题组得到枫香脂挥发油得油率超过20%，枫香脂现在研究比较少，可以获得的数据有限。枫香脂GC-MS结果显示枫香脂挥发油主要成分是由 三甲基肼，3-蒈烯，（1R）-2，6，6-三甲基二环 ［3.1.1］庚-2-烯，2-亚甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基-二环 ［5.2.0］壬烷组成，含有量超过80%，其各自药理学研究还有待于进一步详细研究。

图5 枫香脂挥发油对环氧合酶抑制剂吲哚美辛预处理的PE预收缩的影响Fig.5 L.Resina volatile oil on PE pre-con traction pretreated by indomethacin

舒张血管作用途径总的来说［11-13］，主要通过内皮依耐性增加舒血管活性物质NO及前列腺素的释放，抑制缩血管物质如内皮素等的产生，非内皮途径阻滞钙离子通道、开放钾离子通道等途径发挥舒张血管的作用。枫香脂挥发油与水不溶，在实验过程中我们使用DMSO与挥发油溶解，快速加入血管水浴槽，只有极少部分挥发油接触到血管环产生作用，大部分与水分层，所以进一步与水充分接触是我们进一步研究的保证。文章研究表明枫香脂挥发油具有明显的舒张血管的作用，在其加入终体积分数达到2.0×10-6mL/mL，最大舒张率可达32.67%。经过无钙液培育，发现其血管舒张基本是由于血管内皮细胞引起的，结合一氧化氮合酶抑制剂L-NAME研究我们发现，枫香脂挥发油舒张血管跟一氧化氮合酶合成有关，其有抑制合酶合成作用，结合环氧合酶抑制剂吲哚美辛我们也发现其舒张血管跟环氧合酶也有关。枫香脂挥发油舒张血管详细机制还在进一步研究中。

［1］E1-ReadiM Z，Eid H H，Ashour M L，et al.Variations of the chemica1composition and bioactivity of essentia1oi1s from 1eaves and stems of Liquidambar styraciflua（A1tingiaceae）［J］.J Pharm Pharmacol，2013；65（11）：1653-1663.

［2］蔡爱华，赵志国，陈海珊，等.枫香与缺萼枫香果实挥发性成分的GC—MS分析［J］.桂林理工大学学报，2012，32（2）：245-249.

［3］李建明，宋清宏，耿洪亚，等.阴干对枫香脂中挥发油成分的影响［J］.中成药，2014，36（4）：813-818.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：192.

［5］刘继鑫，王克霞，李朝品，等.水蒸气蒸馏法提取中药挥发油存在的问题及解决方法［J］.时珍国医国药，2008，19（1）：97-98.

［6］张韻慧，冯 靖，晋兴华，等.枫香叶挥发油化学成分的GC-MS分析［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（22）：81-83.

［7］李 梦，玛依努尔·赛买提，李 昭，等.A型行为与高血压患者心理社会事件及血管内皮功能的相关性［J］.中国心理卫生杂志，2008，22（10）：724-728.

［8］刘江华，宓宝斌，廖二元，等.波动性高糖对内皮细胞血管舒张因子合成的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2006，14（1）：55-56.

［9］Itoh T，Kajiwara M，Kitamura K，et al.Effects of vasodi1ator agents on smooth musc1e ce11s of the coronary artery of the pig［J］.Br JPharmacol，1981，74（2）：455-468.

［10］Qui11ey C P，Lin Y S，McGiff JC.Ch1oride anion concentration as a determinant of rena1 vascu1ar responsiveness to vasoconstrictor agents［J］.Br J Pharmacol，1993，108（1）：106-110.

［11］王 政，蒋嘉烨，可 燕，等.三七花总皂苷对大鼠离体胸主动脉的舒张作用及其机制［J］.中国药理学通报，2014，30（7）：956-960.

［12］Hedegaard E R，Stankevicius E，Simonsen U，et al.Nonendothe1ia1 endothe1in counteracts hypoxic vasodi1ation in porcine 1arge coronary arteries［J］.BMC Physiol，2011，11（1）：8.

［13］Durand M J，Gutterman DD.Diversity inmechanisms ofendothe1ium-dependent vasodi1ation in hea1th and disease［J］.Microcirculation，2013，20（3）：239-247.

Vasodilatory effect of Liquidambaris Resina volatile oil on rats aorta in vitro

LIJian-ming1， WANG Zheng2， CHEN Chuan1*， SONG Qing-hong1
（1.ShanghaiGeriatric Institute of ChineseMedicine，Shanghai200031，China；2.College of Pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIMTo investigate the vasodi1atory effect of Liquidambaris Resina steam-vo1ati1e oi1on the iso1ated thoracica aorta and exp1ore its possib1emechanism.METHODSThe ana1ysis of Liquidambaris Resina vo1ati1e oi1was performed on gas chromatography-mass spectrometry.Iso1ated SD rataortic vascu1ar was used in vitro to the vascu1ar ring experiment，observing the pre-contraction effect caused by pheny1ephrine，aswe11as by nitric oxide synthase inhibitor L-NAME and cyc1ooxygenase inhibitor indomethacin on vascu1ar ring.RESULTSGC-MS data showed that themain constituents of vo1ati1e oi1were trimethy1-hydrazine，3-carene，（1R）-2，6，6-trimethy1bi-cyc1o［3.1.1］hept-2-ene，2-methy1ene-4，8，8-trimethy1-4-viny1-bicyc1o-［5.2.0］nonane.Vo1ati1e oi1 had a significant pre-contracted effect caused by PE，and the va1ue ofmaximum re1axation was32.67%.After L-NAME and indomethacin incubating with vascu1ar ring for 0.5 h，they cou1d marked1y inhibit vasodi1ation.CONCLUSIONLiquidambaris Resina vo1ati1e oi1has significant vasodi1ation for SD rats，and ismain1y re1ated to the activation of nitric oxide synthase and cyc1ooxygenase pathway.

Liquidambaris Resina；vo1ati1e oi1；GC-MS；vascu1ar ring experiment；L-NAME；indomethacin

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1659-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.006

2014-08-19

李建明 （1967—），男，博士，研究员，研究方向为中医老年医学理论与技术、中医药防治老年病新技术和新产品研发。Te1：（021）6470010，18817395027，E-mai1：1ijianmingg@vip.sina.com

*通信作者：陈 川 （1963—），男，硕士生导师，主任医师，研究方向为中医药防治老年性痴呆、动脉粥样硬化及延缓衰老。Te1：（021）64720010，E-mai1：shagetcm@126.com