子痫前期患者CD4+CD25+调节性T细胞亚群的改变及意义

喻晴 楼向明

子痫前期患者CD4+CD25+调节性T细胞亚群的改变及意义

喻晴 楼向明

目的钼探讨子痫前期患者CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）亚群改变及在PE免疫耐受失衡中的作用。方法钼选取PE患者（观察组）30例，同期正常晚期妊娠（对照组）20例。分别采集PE患者和正常晚期妊娠妇女外周血，采用流式细胞术检测Treg以及活化记性相关（CD45RO、HLA-DR）、归巢相关（CCR4、CCR6、CD103）、功能相关（ICOS、CTLA-4、Galectin 1）和生存相关（PD1和CD95）标记分子的表达。采用免疫抑制实验检测外周血中Treg的免疫抑制功能。 结果 观察组患者外周血CD4+CD25+细胞的比例[(5.87±3.34)%]低于对照组[（6.65±1.18）%]，但差异无统计学意义。免疫抑制实验显示观察组患者外周血中Treg对CD4+CD25-T细胞的增值抑制作用与对照组无统计学差异。通过对Treg多个标记分子的检测进一步发现，ICOS和CCR6在观察组Treg上的表达水平显著低于对照组Treg（均P＜0.01）；CCR4和Galectin 1的表达水平较对照组低，而CD45RO、HLA-DR、CD103、CTLA、PD1和CD95的表达水平较对照组高，但两组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论 Treg亚群比例失调可能是导致子痫前期发生的重要因素。

子痫前期 调节性T细胞 ICOS CCR6

子痫前期（pre-eclampsia，PE），又称先兆子痫，是指妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24h，或随机尿蛋白（+）[1]。PE是孕妇和围生儿发病和死亡的主要原因之一，全球发病率高达7%～10%，发病机制尚不明确。自1976年James提出PE免疫适应不良学说后，有不少研究者认识到免疫系统的异常激活在病因学中起到的重要作用。调节性T细胞（Treg）是最重要的免疫抑制细胞，能在体内和体外抑制其它免疫细胞 [如CD4+和CD8+T细胞、自然杀伤细胞（NK）和自然杀伤T细胞（NKT），B细胞和抗原递呈细胞（APCs）]的活化、增生和效应功能[2]。既往研究表明，PE患者外周血Treg表达下调，造成母胎免疫失衡而导致PE发生[3]。近年来，随着对Treg认识的深入，发现Treg可表达大量的分子标记。这些标记分子根据其作用不同可归纳为5类：转录因子、活化记性相关（CD45RO、HLA-DR）、归巢相关（CCR4、CCR6、CD103）、功能相关（ICOS、CTLA-4、Galectin 1）和生存相关（PD1和CD95）标记分子[4]。有学者根据Treg某些分子标记的表达与否，进一步将Treg分为不同亚群。本研究观察子痫前期患者外周血Treg亚群改变，旨在进一步探讨Treg在PE发生过程中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象和分组 2013年5至12月杭州市第一人民医院产科收治的PE患者30例（观察组）；年龄22～30（26.6±2.9）岁；孕34～40（37.4±3.7）周；诊断标准；PE为妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24h，或随机尿蛋白（+），具体参照谢幸主编第8版《妇产科学》中的标准，所有对象均为剖宫产。既往均无高血压、糖尿病、甲亢等病史，无其他妊娠合并症及并发症，无传染病病史。选择同期产前检查正常的晚期妊娠妇女20例为对照组，年龄23～30（27.4±3.2）岁；孕35～40（37.9±3.1）周；两组年龄及孕周比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 主要试剂 PE标记的小鼠抗人荧光抗体：CCR6、CTLA-4、ICOS、Galectin-1、PD1和CD95；FITC标记的小鼠抗人荧光抗体：CD4、HLA-DR、CD103；APC标记的小鼠抗人荧光抗体：CD25；PECY7标记的小鼠抗人荧光抗体：CD4、CD45RO、CCR4。上述抗体以及Cytofix/Cytoperm破膜剂均购自美国BD PharMingen公司。CD4+CD25+Treg分离试剂盒购自德国美天旎公司。

1.3 实验方法 采集两组孕妇外周血，各10ml肝素抗凝。

1.3.1 外周血单核淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分离 将肝素抗凝的外周血加在与血液等量的Ficoll淋巴细胞分离液上，行密度梯度离心（500g×20min，温度10℃）；收集单个核细胞层细胞，加1～2倍量的PBS液，混匀后离心200g×10min，去上清液；PBS液洗涤细胞2次后，再用含10%小牛血清的PBS液将细胞配成适当浓度，等待检测。

1.3.2 细胞表面及胞内染色以及检测 在每个流式上样管中加入100μl准备好的细胞悬液，细胞浓度约为1×106cells/ml，分别加入荧光抗体各20μl，4℃避光孵育30min；加1ml PBS洗涤1遍；如行胞内染色，在完成胞外染色后，需加破膜剂1ml室温孵育20min，PBS洗涤后在加入再加入荧光抗体20μ1，4℃避光孵育30min，PBS洗细胞1次，然后加100μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

1.3.3 免疫抑制实验 采用CD4+CD25+Treg分离试剂盒，按照公司说明书，从PBMCs中分离获得CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T细胞。在96孔板中，每孔加入2.5×104个Treg，然后按不同比例的接入CD4+CD25-T细胞（Treg：CD4+CD25-T细胞=0∶1、0.5∶1和1∶1，每组设3复孔），再加入抗CD3（2.5μg/m）和CD28抗体（5μg/ml）共同孵育。4d后加入[3H]胸苷（每孔0.5μCi）再孵育16h。收集细胞并通过闪烁计数器计数。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，测得计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 两组孕妇外周血中CD4+CD25+Treg的比例 见图1。

图1 两组孕妇外周血中CD4+CD25+Treg的比例（A：两组孕妇外周血中CD4+/CD4+CD25+流式细胞图；B：两组Treg在CD4+T细胞中的比例图）

由图1可见，经流式细胞术检测结果显示对照组外周血中Treg比例为（5.87±3.34）%，低于观察组的（6.65±1.18）%，但两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。2.2 免疫抑制实验检测Treg对CD4+CD25-T细胞增殖抑制的情况 见图2。

由图2可见，外周血中Treg免疫抑制功能的研究发现，两组Treg对CD4+CD25-T细胞的增值均有显著的抑制作用，且呈浓度依赖性；虽然对照组外周血中Treg的免疫抑制能力强于观察组来源的Treg，但是两者间无统计学差异。

2.3 流式细胞术检测外周血Treg上ICOS、CCR6、CCR4和Galectin 1的表达情况 见图3。

由图3可见，观察组外周血Treg上ICOS和CCR6的表达显著低于对照组（均P＜0.01），观察组外周血Treg上CCR4和Galectin 1的表达低于对照组，但两组间差异无统计学意义。

图2 免疫抑制实验检测Treg对CD4+CD25-T细胞增殖抑制的情况

图3 流式细胞术检测外周血Treg上ICOS、CCR6、CCR4和Galectin 1的表达情况[观察组（实线，黑柱体），对照组（虚线，白柱体），**P＜0.01]

2.4 两组孕妇外周血Treg上分子标记检测结果比较 见表1。

表1 两组孕妇外周血Treg上分子标记检测结果比较

由表1可见，观察组外周血Treg上ICOS和CCR6的表达显著低于对照组（均P＜0.01），结果与图3相同。CD45RO、HLA-DR、CD103、CTLA-4、PD1和CD95的表达水平较对照组高，但两组间差异亦无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

Treg是一类免疫调节细胞，在维持自身免疫耐受中发挥重要作用，是1995年由Sakaguchi等[5]首次报道后引起广泛关注的。它是CD4+T细胞的一个独特亚型，在胸腺中产生，以成熟状态释放到外周血中，在自身免疫性疾病的发生、外周T细胞的自身稳定以及免疫移植中起着重要的作用。CD4+CD25+Treg的两大功能特征是免疫抑制和免疫无能。近些年的研究表明，在妊娠的各个时期，母体的外周血、蜕膜中都有CD4+CD25+Treg的存在，提示CD4+CD25+Treg在PE的发生过程中发挥重要作用。既往有学者报道PE孕妇外周血中CD4+CD25+Treg与正常妊娠孕妇相比无统计学差异[6]；也有报道PE孕妇外周血中CD4+CD25+Treg显著低于正常妊娠孕妇[7]。本研究通过流式细胞术和免疫功能抑制实验证实，两组孕妇Treg的表达和功能均无统计学差异，与部分文献报道不一致[3，7]。其最主要原因在于鉴定Treg标记物的不同。转录因子FoxP3是控制Treg发展和功能的关键分子，是鉴定Treg的一个特异标志。

目前已知，Treg表面可表达各种标记分子，并对Treg的活化、记忆、组织定位及生存等多个方面都产生重要影响，从而在很大程度上决定了体内Treg的功能发挥。可诱导共刺激分子（ICOS）是CD28家族的第3个成员。最新研究表明ICOS在CD4+CD25+Treg表达与其免疫抑制功能相关。Ito等[8]根据ICOS的不同表达，将Treg分为ICOS+Treg和ICOS-Treg两个不同的细胞亚群。ICOS+Treg不仅高表达和免疫抑制相关的因子，如IL-10、TGF-β和IL-35，还表达大量和凋亡相关的Fas-FasL及颗粒酶B，这些均使ICOS+Treg较ICOS-Treg有更强的免疫抑制功能。最近，通过对肿瘤患者的研究显示，ICOS+Treg主要集中在肿瘤浸润淋巴结中，而ICOSTreg则主要分布在患者外周血中。本研究分析了PE孕妇外周血Treg表面ICOS的表达，结果显示PE孕妇外周血Treg表面ICOS表达水平显著低于正常妊娠孕妇，提示ICOS+Treg比例下调是导致PE发生的更为确切的因素。

另一方面，Treg免疫抑制功能的发挥除了由其自身能力决定外，还与Treg在组织内的定位密切相关[9]。而Treg表面的趋化因子受体是决定其组织定位的关键因素。Treg细胞表面可表达多种趋化因子受体，如CCR4、CCR6和CCR7等。CCR4被证实主要与Treg向肿瘤组织迁移相关[9-10]。而最新研究发现，CCR6也可介导Treg向多种肿瘤组织迁移[11-12]。更为重要的是，CCR6还与Treg向炎症组织迁移密切相关[13]。本研究发现PE孕妇外周血Treg表面CCR6表达显著低于正常妊娠孕妇，提示PE孕妇外周血中通过CCR6介导进入胎盘蜕膜组织中的Treg显著少于正常妊娠孕妇，进而可能增加PE发生的概率。

综上所述，本研究结果提示CD4+CD25+Treg亚群比例失调可能是导致Treg相关PE发生的更为确切的机制。本研究结果可为PE的免疫平衡疗法提供新的靶点。

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（本文编辑：沈昱平）

《浙江医学》对计量单位的要求

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本刊编辑部

Changes of regulatory T cells in peripheral blood of patients w ith preeclampsia

YU Qing,LOU Xiangming.Department of Obstet-rics and Gynecology,Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital,Hangzhou 310008,China

Objective To investigate the changes of regulatory T cells(CD4+CD25+Treg)in peripheral b lood of patients w ith p reec lampsia(PE).Methods Peripheralb lood of30 patients w ith PE and 20 normalg ravidas w ith late p regnancy were enrolled.The exp ression of CD4+CD25+Treg and its markers related to activation(CD45RO,HLA-DR),hom ing(CCR4,CCR6, CD103),func tion(ICOS,CTLA-4,Galectin 1)and survival(PD 1 and CD95)were detected using flow cytometry.Immunosupp ression function of Treg in vitro was detected by immunosupp ression assay,Results The p roportion of CD4+CD25+Treg among CD4+T cells was 5.87±3.34%in patients w ith PE,lower than that in controlgroup(6.65±1.18%,P＞0.05).Immunosupp ression assay showed sim ilar supp ression power of Treg from the two groups.The exp ression of ICOS and CCR6 on Treg in patients w ith PEwas significantly lower than that in normalp regnancy sub jects(P＜0.01).The exp ression of CCR4 and Galectin 1 was decreased but that of CD45RO,HLA-DR,CD103,CTLA,PD1 and CD95 was inc reased in patients w ith PE.However,the d ifferences between the two g roups were not significant.Conclusion Imbalance of Treg subsets may be an important fac tor leading to the occurrence ofp reec lam psia.

Preec lam psia Regulatory T cell ICOS CCR6

2014-04-07）

310008杭州市妇产科医院妇产科