鸦胆子素D对人胰腺癌细胞株Panc-1体外增殖的抑制作用

王飞达 王兆洪 张跃 童洪飞 王向昱 王继生

●论 著

鸦胆子素D对人胰腺癌细胞株Panc-1体外增殖的抑制作用

王飞达 王兆洪 张跃 童洪飞 王向昱 王继生

目的钼探讨鸦胆子素D对人胰腺癌细胞株Panc-1体外增殖的影响。方法钼人胰腺癌细胞株Panc-1经不同浓度（0、5、10、20、40、60μmol/L）鸦胆子素D分别作用24、48、72 h后，应用CCK-8法检测鸦胆子素D对Panc-1细胞的增殖抑制作用；流式细胞术检测Panc-1细胞凋亡情况；Western b lot检测Panc-1细胞经0、5、10、20、30、60μmol/L的鸦胆子素D处理24h后以及20μmol/L的鸦胆子素D处理24、48、72 h后，细胞中Bax及Bc l-2的表达。结果 鸦胆子素D对Panc-1细胞的增殖抑制作用呈明显浓度和时间依赖性，60μmol/L时对Panc-1作用24、48、72 h后细胞存活率分别为54.44%、33.00%、21.63%，凋亡率分别为47.29%、63.80%、72.16%；0、5、10、20、30、60μmol/L的鸦胆子素D作用于Panc-1细胞72h后的细胞存活率是100%、71.60%、60.37%、46.78%、39.98%、21.63%，凋亡率分别为0、26.63%、45.62%、56.18%、62.21%、72.16%；随着鸦胆子素D作用时间的延长或浓度的增加Bax蛋白的表达升高，Bc l-2蛋白的表达降低。结论 鸦胆子素D可显著抑制人胰腺癌Panc-1细胞生长，并促进其凋亡，在一定的浓度和时间范围内，其作用呈明显浓度和时间依赖性，其作用机制可能是通过促进Bax的表达，降低Bc l-2的表达实现的。

鸦胆子素D胰腺癌 增殖 Bax Bc l-2

胰腺癌由于位置深，起病隐匿，发现时已多属晚期，且病情发展迅速，治疗效果较差。目前以吉西他滨为基础的化疗是治疗胰腺癌最主要的内科治疗手段[1]，国内外有许多关于吉西他滨联合用药治疗晚期胰腺癌的试验，如吉西他滨联合顺铂、靶向药物等治疗胰腺癌，在一定程度上能改善胰腺癌的治疗效果[2]。近年来中医药抗癌研究取得了重大进展，国内外已有研究报道大黄素、姜黄素等能显著抑制胰腺癌细胞的增殖[3-4]。有报道表明，鸦胆子素对肝癌、肺癌、乳腺癌等众多肿瘤细胞的增殖有抑制作用[5]，但其作用机制尚未完全明确。故我们通过研究不同浓度的鸦胆子素D对胰腺癌细胞生长的影响，探讨其可能的作用及其机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要药品和试剂 鸦胆子素D（纯度＞98%），产品批号：Y0001196（美国Sigma公司），用二甲基亚砜（DMSO）配制成0.2m mol/L（DMSO的终浓度＜0.05%）；胎牛血清、胰酶、RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒，批号C0038（中国碧云天生物技术研究所）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒批号TY4681（中国南京凯基生物发展有限公司）；Bax抗体，批号：1063-1、Bcl-2抗体，批号：1017-1和β-actin抗体，批号：1854-1（Epitomics公司，美国）。

1.2 细胞培养 人胰腺癌细胞Panc-1（购于美国模式培养物集存库，ATCC）培养于含10%胎牛血清、100μ/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置于含5%CO2，37℃细胞培养箱中培养，每3d换液1次。细胞单层贴壁生长，约80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率 收集处于对数生长期的Panc-1胰腺癌细胞，接种到96孔板，4×103个/孔，细胞贴壁后，分别加入不同浓度鸦胆子素D（0、5、10、20、30、60μmol/L）分别作用24、48、72h，每组重复5孔。同时设置空白调零组（不加细胞加入等量的PBS）。药物作用结束前1h，各孔加入0.01ml CCK-8，继续培养1h，酶标仪（Bio-Tek，ELX800美国宝特）测定波长450nm处的吸光度值测（A值），实验重复3次。细胞存活率=（实验组A值－空白调零A值）/（对照组A值－空白调零A值）×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/ PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。将4×105个处于对数生长期的Panc-1细胞接种在6孔培养板中，生长至90%融合时，分别加入不同浓度鸦胆子素D（0、5、10、20、30、60μmol/L）分别作用24、48、72h后，胰蛋白酶消化，1 000r/min离心5min。冷PBS洗2次，按Annexin V-FITC/ PI凋亡检测试剂盒说明用500μl Binging Buffer重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI混匀，室温避光作用15min上机检测，检测细胞数为1×104/组。激发波长488nm，发射波长530nm。Cellquest软件分析。

1.5 Western blot检测Panc-1胰腺癌细胞蛋白Bax和Bcl-2的表达 收集处于对数生长期的Panc-1胰腺癌细胞经30μmol/L鸦胆子素D作用24、48、72h后，RIPA裂解液裂解，提取上清液，测量蛋白浓度。取等量蛋白质样品（20μg/孔），8%SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭后滴加兔抗人Bax或者Bcl-2抗体为第一抗体，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体，ECL显色，X线胶片曝光。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，测得计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞增殖的影响 0、5、10、20、30、60μmol/L鸦胆子素D分别作用24h后细胞的存活率是100%、92.84%、86.50%、80.16%、75.39%、 54.44%；作用48h后细胞的存活率是100%、76.86%、68.71%、60.87%、50.24%、33.00%；作用72h后细胞的存活率是 100%、71.60%、60.37%、46.78%、39.98%、21.63%。相同的作用时间，随着鸦胆子素D浓度的提高细胞的存活率逐渐降低（P＜0.05）；相同浓度的鸦胆子素D随时间的延长细胞的存活率逐渐降低（P＜0.05）。详见图1。

图1 鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞增殖的影响

2.2 鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞凋亡的影响 0、5、10、20、30、60μmol/L鸦胆子素D分别作用24h后细胞的凋亡率是0、11.02%、17.13%、26.51%、35.37%、47.29%；作用48h后细胞的凋亡率是0、18.13%、29.56%、43.56%、50.26%、63.80%；作用72h后细胞的凋亡率是0、26.63%、45.62%、56.18%、62.21%、72.16%。相同的作用时间，随着鸦胆子素D浓度的提高细胞的凋亡率逐渐升高（P＜0.05）；相同浓度的鸦胆子素D，随时间的延长细胞的凋亡率逐渐升高（P＜0.05）。详见图2。

图2 鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞凋亡的影响

2.3 Western blot检测Panc-1胰腺癌细胞Bax和Bcl-2蛋白的表达 30μmol/L鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞作用0、24、48、72h后，Bax蛋白表达随鸦胆子素D作用时间延长而上调，Bcl-2蛋白的表达则随作用时间延长而下调（见图3）。0、5、10、20、30、60μmol/L鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞作用24h后，Bax蛋白表达随鸦胆子素D浓度增加而上调，Bcl-2蛋白的表达则随浓度增加而下调（见图4）。

3 讨论

鸦胆子，别名老鸦胆、苦参子，为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实。临床上将10%鸦胆子油乳剂用于治疗消化系统肿瘤，如胃癌、食管癌、原发性肝癌、大肠癌、胰腺癌等,效果显著。有研究发现，鸦胆子中的一种单体鸦胆子素D能够诱导胰腺癌细胞的凋亡[6-7]。本实验中胆子素D既能抑制胰腺癌Panc-1细胞增殖，也能够诱导胰腺癌细胞的凋亡。相同的作用时间，随着鸦胆子素D浓度的提高细胞的存活率降低，凋亡率逐渐升高（P＜0.05）；相同浓度的鸦胆子素D，随时间的延长存活率降低，凋亡率逐渐升高（P＜0.05）。即鸦胆子素D对胰腺癌的抑制作用有时间和浓度依赖性。

图3 30μmol/L鸦胆子素D作用Panc-1细胞后Bax及Bcl-2蛋白的表达情况

图4 0、5、10、20、30、60μmol/L鸦胆子素D对Panc-1胰腺癌细胞作用24 h后，Bax蛋白表达情况

细胞的凋亡受多种基因的调节，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族重要的凋亡调控基因，通常情况下是以异源二聚体的形式存在的，Bcl-2和Bax与多种肿瘤和非肿瘤病变的发生、发展有关。研究表明，Bcl-2/Bax比例是决定细胞对凋亡的调节有重要作用。当比例增高时，细胞凋亡受到抑制，反之，细胞易于发生凋亡。有实验证明，鸦胆子对胃癌细胞增殖有显著的抑制作用，其可能的机制是Bcl-2蛋白表达水平下降，而Bax蛋白表达水平升高诱导凋亡的发生[8]。鸦胆子素D是鸦胆子的主要成分，本实验结果显示Panc-1胰腺癌细胞受鸦胆子素D作用后Bcl-2蛋白的表达降低，而Bax蛋白的表达升高。在本实验的浓度范围内随着鸦胆子素D浓度的增高及时间的延长，Bcl-2蛋白表达也相应的降低，Bax蛋白的表达升高。

本实验初步证实鸦胆子素D能够抑制胰腺癌细胞的增殖并促进其凋亡，其机制可能是通过改变Bcl-2/ Bax异源二聚体而实现的抗凋亡的。鸦胆子素D对胰腺癌影响的具体机制有待进一步研究。

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Brucein D inhibits proliferation and induces apoptosis of PANC-1 pancreatic adenocarcinoma cell line

WANG Feida,WANG Zhao-hong,ZHANG Yue,et al.Department of Internal Chinese Medicine,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012, China

Objective To investigate the effec t of b rucein D(BD)on p roliferation and apop tosis of pancreatic adenocarcinoma cells.Methods Human pancreatic cancer PANC-1 cells were treated with 0,5,10,20,30 and 60μmol/LBD for 24, 48 and 72h.The cellp roliferation was detected by cellcounting kit-8(CCK-8)assay,cellapop tosis was detec ted using Annexin V-FITC/PI.The p rotein exp ressions of Bax and Bc l-2 were detected using Western b lot.Results BD significantly inhibited p roliferation of PANC-1 cells,up-regulated Bax p rotein exp ression and down-regulated Bc l-2 exp ression in a dose-and time-dependentmanner(P＜0.05).Conclusion BD can significantly inhibit the p roliferation and induce apop tosis of PANC-1 cells in vitro,which is associated w ith up-regulation the exp ression of Bax and down-regulation the exp ression of Bc l-2.

Brucein D Pancreatic carcinoma Proliferation Bax Bc l-2

2015-03-05）

（本文编辑：沈昱平）

浙江省温州市科技局计划项目（Y20130099）

310012杭州，浙江省立同德医院中医内科（王飞达）；温州医科大学附属第二医院肝胆外科（王兆洪、张跃、童洪飞、王向昱、王继生）

王兆洪，E-mail:wangzhaohong55@163.com