鸦胆子素D对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响及其机制

田姗，曹霞，李翔，李曾

西安交通大学医学院附属三二〇一医院，陕西汉中732000

肺癌是临床常见的呼吸系统恶性肿瘤，全球每年新增病例达180万例，死亡约160万例[1]。根据其组织病理学主要分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两类，其中85%～90%为NSCLC[2]。大多数NSCLC患者确诊时已处于中晚期，错过了根治性手术的最佳时机，以铂类为主的化疗成为其主要治疗手段[3]，但患者预后并不理想，5年生存率不足15%[4-5]。随着分子细胞水平研究的深入，相继有靶向药物问世，为中晚期恶性肿瘤患者带来了福音。但靶向药物价格普遍昂贵，超出了普通家庭的支付能力。近年研究发现，许多天然化合物表现出较强的抗肿瘤活性，如小檗碱、姜黄素、鸦胆子素D等[6-8]。鸦胆子素D是从鸦胆子果实中提取的一种水溶性三环四萜类化合物。鸦胆子素D与紫杉醇联用能够显著抑制胰腺癌细胞增殖[9]。鸦胆子素D亦可抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡[10]。但目前鸦胆子素D对NSCLC的作用报道较少。2018年12月—2020年5月，本研究探讨了鸦胆子素D对NSCLC细胞生物学行为的影响及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 NSCLC细胞系A549、PC9、H1975、H460(以下分别称A549、PC9、H1975、H460细胞)，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。鸦胆子素D，纯度>98%(HPLC)，规格20毫克/支，购自上海盛中医药化工有限公司。将鸦胆子素D用DMSO溶解后配制成1 mmol/L母液分装，置于-20 ℃冰箱保存备用。Multiskan FC酶标仪，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；FACScan流式细胞仪，购自美国BD公司；Amersham Imager 600凝胶成像系统，购自美国GE公司。细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒，购自江苏碧云天生物技术有限公司。JNK、p-JNK、β-actin一抗以及辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，购自美国Cell Singnaling Technology公司。

1.2 细胞传代培养 取A549、PC9、H1975、H460细胞，接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。当细胞生长融合90%左右时，用含EDTA的0.25%胰酶消化，按1∶4传代。

1.3 NSCLC细胞和鸦胆子素D浓度筛选 取传4代、对数生长期、生长状态良好的NSCLC细胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化并计数，以2×103个/孔接种于96孔板，每孔200 μL，然后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24 h，分别加入100、200、300、400、500 μmol/L鸦胆子素D 10 μL，使鸦胆子素D终浓度分别为5、10、15、20、25 μmol/L，每个浓度设6个平行孔。同时，设置阴性对照组和空白对照组。继续培养48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h。弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡混匀，直至结晶充分溶解。酶标仪于570 nm波长处检测各孔的光密(OD)值，计算细胞存活率和鸦胆子素D的50%抑制浓度(IC50)。细胞存活率=(药物干预组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。根据IC50选择对鸦胆子素D敏感度适中的NSCLC细胞和接近IC50时的药物浓度进行后续实验。

1.4 细胞周期检测 采用PI染色法。取上述筛选的NSCLC细胞6×105个，置于6 mL培养液中混匀。取细胞悬液1 mL，接种于6孔板，随机分为观察组和对照组，每组设3个平行孔，然后将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h；弃去旧培养液，对照组加入新鲜培养液3 mL，观察组加入含鸦胆子素D的新鲜培养液3 mL，继续培养48 h；1 000 r/min离心5 min、离心半径8 cm，向细胞沉淀中加入冰冷的无水乙醇1 mL，使乙醇的终浓度为70%，4 ℃固定24 h。收集细胞，分别加入含50 mg/mL PI、100 mg/mL RNase A的染色液500 μL，常温避光染色30 min，上流式细胞仪检测。采用ModFit LT软件分析细胞周期中G1、S、G2/M期细胞比例。

1.5 细胞凋亡检测 采用Annexin V-FITC/PI双染法。取上述筛选的NSCLC细胞6×105个，置于6 mL培养液中混匀。取细胞悬液1 mL，接种于6孔板，随机分为观察组和对照组，每组设3个平行孔，然后将6孔板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h；弃去旧培养液，对照组加入新鲜培养液3 mL，观察组加入含鸦胆子素D的新鲜培养液3 mL，继续培养48 h；1 000 r/min离心5 min、离心半径8 cm，收集细胞，加入Annexin V-FITC结合液195 μL重悬细胞，然后分别加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，上流式细胞仪检测。

1.6 JNK信号通路蛋白表达检测 采用Western blotting法。取上述筛选的NSCLC细胞4×105个，接种至培养皿，随机分为观察组和对照组，每组设3个平行培养皿，然后将培养皿置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24 h；弃去旧培养液，对照组加入新鲜培养液3 mL，观察组加入含鸦胆子素D的新鲜培养液3 mL，继续培养48 h。收集两组细胞，加入细胞裂解液1 mL，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。然后加入1×loading buffer缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白30 μg，SDS-PAGE分离蛋白(5%浓缩胶、15%分离胶)，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入JNK、p-JNK、β-actin一抗(稀释比均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(稀释比1∶4 000)，室温孵育1 h。ECL发光，暗室中曝光、显影。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 NSCLC细胞和鸦胆子素D浓度筛选结果 随着鸦胆子素D浓度升高，A549、PC9、H1975、H460细胞存活率逐渐降低，呈浓度依赖性(F分别为42.214、36.251、45.014、65.204，P均<0.01)，见表1。鸦胆子素D对A549、PC9、H1975、H460细胞的IC50分别为19.81、18.98、15.51、10.62 μmol/L。A549、PC96、H1975、H460细胞对鸦胆子素D的敏感度依次增强，故选择敏感度适中的PC9、H1975细胞，以15 μmol/L鸦胆子素D进行后续实验。

表1 不同浓度鸦胆子素D干预下4种NSCLC细胞存活率变化

2.2 PC9、H1975细胞经鸦胆子素D干预后细胞周期变化 见表2、3。

表2 PC9细胞经鸦胆子素D干预后细胞周期变化

2.3 PC9、H1975细胞经鸦胆子素D干预后细胞凋亡率变化 PC9细胞：观察组细胞凋亡率为(46.2±5.9)%，对照组为(5.5±1.3)%，观察组细胞凋亡率明显高于对照组(t=11.652，P<0.01)。H1975细胞：观察组细胞凋亡率为(53.2±4.8)%，对照组为(4.5±1.1)%，观察组细胞凋亡率明显高于对照组(t=16.861，P<0.01)。

表3 H1975细胞经鸦胆子素D干预后细胞周期变化

2.4 PC9、H1975细胞经鸦胆子素D干预后JNK信号通路蛋白表达变化 PC9细胞：观察组JNK蛋白相对表达量为0.97±0.08，p-JNK蛋白相对表达量为0.21±0.03，对照组分别为0.96±0.10、0.92±0.14；观察组p-JNK蛋白相对表达量明显低于对照组(t=21.352，P<0.01)，两组JNK蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=0.032，P>0.05)。H1975细胞：观察组JNK蛋白相对表达量为0.87±0.04，p-JNK蛋白相对表达量为0.15±0.02，对照组分别为0.89±0.06、0.87±0.09；观察组p-JNK蛋白相对表达量明显低于对照组(t=19.254，P<0.01)，两组JNK蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=0.962，P>0.05)。

3 讨论

目前，临床对于中晚期NSCLC主要采取以化疗为主的综合治疗。常用的化疗药物为细胞毒类，能够直接杀伤肿瘤细胞，但同时也会损害机体快速增殖的细胞，如免疫细胞、骨髓干细胞，从而抑制机体免疫系统。近年研究发现，许多天然化合物表现出较强的抗肿瘤活性。这些天然化合物配合化疗药物治疗恶性肿瘤，不仅能提升化疗药物的抗肿瘤效果，还能减轻其毒副反应，成为近年来研究的热点。

鸦胆子是苦木科植物鸦胆子的成熟果实。鸦胆子成熟的种子是一种传统中药，被收录于2015版《中国药典》，用来治疗痢疾、疟疾、鸡眼等。梁子宁等[11]研究发现，鸦胆子提取物对口腔念珠菌具有较强的抑制作用。杨丹等[12]研究发现，鸦胆子油乳剂能够使高脂血症沙鼠血清胆固醇酰基转移酶活性显著增强，心肌和肝脏的脂蛋白脂肪酶活性亦显著升高，提示鸦胆子油乳剂具有明显的调脂作用。近年研究发现，鸦胆子还具有一定的抗肿瘤活性[13]。鸦胆子素D是从鸦胆子成熟果实中分离出的一种水溶性三环四萜类化合物，该化合物具有高效的抗胰腺癌、肝癌、结肠癌活性[14-15]。但目前鸦胆子素D对NSCLC的作用报道较少。本研究结果显示，鸦胆子素D在体外对NSCLC细胞具有一定的抗肿瘤活性，在一定浓度范围内鸦胆子素D(5～25 μmol/L)对A549、PC9、H1975、H460细胞的抑制作用具有浓度依赖性，并且A549、PC9、H1975、H460细胞对鸦胆子素D的敏感度依次增强。在后续研究中，选择敏感度适中的PC9、H1975细胞，以15 μmol/L鸦胆子素D进行实验。

细胞周期特异性药物主要杀伤处于增殖周期的肿瘤细胞，能够通过将细胞阻滞于某一时期进而抑制肿瘤细胞增殖。为了探究鸦胆子素D是否具有阻断细胞周期的作用，我们观察了15 μmol/L鸦胆子素D对PC9、H1975细胞周期的影响。结果发现，无论是PC9细胞还是H1975细胞，观察组G1期细胞比例均低于对照组，G2/M期细胞比例均高于对照组，表明鸦胆子素D可阻滞PC9、H1975细胞于G2/M期，延长细胞增殖周期，抑制NSCLC细胞增殖。本研究发现，无论是PC9细胞还是H1975细胞，观察组细胞凋亡率均高于对照组，表明鸦胆子素D可促进NSCLC细胞凋亡。JNK是丝裂原活化蛋白激酶的主要成员，JNK信号通路在调节细胞存活和细胞凋亡过程中发挥重要作用。BAI等[16]研究发现，蛋白质二硫键异构酶家族6可通过调节MAP4K1/JNK信号通路的传导影响NSCLC细胞的生物学功能。TAN等[17]研究报道，丁氨酸D可通过调节JNK信号通路诱导人NSCLC细胞凋亡。本研究发现，无论是PC9细胞还是H1975细胞，观察组p-JNK蛋白相对表达量均低于对照组，而两组JNK蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义，提示鸦胆子素D可能是通过抑制JNK信号通路传导，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。

综上所述，鸦胆子素D可能通过抑制JNK信号通路传导，抑制NSCLC细胞增殖，阻滞细胞周期进程，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。