基于网络药理学探讨中药鸦胆子治疗非小细胞肺癌的作用机制

桑舒柳，丁蓉珍，姜靖洁，龚亚斌*

1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肿瘤科，上海，200437。

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，占所有癌症死亡的18.4%[1]。肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中约85%为非小细胞肺癌[2]。随着医学的发展，中医药可以改善肿瘤分子靶向药物耐药、改善多药耐药、逆转化疗耐药、协同增效及放疗增敏，同时减轻放、化疗副作用[3]。中医药在治疗恶性肿瘤的应用范围越来越广，通过增效减毒提高患者的生存期和生活质量。

中药鸦胆子（Brucea javanica）为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，具有清热解毒、截疟、止痢的功效；外用可治疗腐蚀赘疣[4]。鸦胆子的临床应用大多是炼成鸦胆子油后被制备成乳剂或者软胶囊，辅助治疗各种癌症[5]，联合放、化疗提高其抗癌疗效和安全性，缓解肿瘤恶病质[6-10]。大量研究表明鸦胆子能通过触发活性氧(ROS)的生成、细胞色素C 的释放、线粒体凋亡通路的激活以及一系列与癌症相关的信号通路和蛋白的调控来抑制肿瘤细胞增殖凋亡[11,12]，但其治疗非小细胞肺癌的具体活性成分和机制尚不明确。

网络药理学能通过可视化数据采集分析预测药物治疗疾病的靶点和机制。因此，本文通过网络药理学对鸦胆子治疗非小细胞肺癌的主要活性成分和作用相关通路和靶点进行探讨，以期为临床治疗疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 化合物有效成分及潜在靶点的收集

以“鸦胆子”为检索词，在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（http: //tcmspw.com/tcmsp.php）中检索其包含的化学成分，满足生物利用度（OB）≥ 30%，类药性（DL）≥0.18 的化合物被选择。查阅文献补充 TCMSP 中未预测到的有效化合物成分，在化源网搜CAS 号随后在Pubchem 提取化学成分相对应的SMILE 号，在Swiss Target Prediction 数据库中找出SMILE 号对应的靶点。

1.2 治疗靶点的筛选

设置关键词为“non-small cell lung cancer”，检索Genecard （www.genecards.org） 和DisGeNET（www.disgenet.org）数据库，选择“Homo sapiens”，检索出NSCLC 靶点。取鸦胆子活性成分靶点与疾病靶点的并集作为“鸦胆子”治疗NSCLC 的潜在靶点，绘制韦恩图。

1.3 构建鸦胆子活性成分-作用靶点网络图

将上面筛选出的靶点导入Cytoscape Version 3.7.2 软件，构建鸦胆子活性成分-非小细胞肺癌靶点网络，并进行网络拓扑学分析，根据节点的度值筛选出其治疗NSCLC 的核心化合物。

1.4 构建蛋白相互作用（PPI）网络

将 1.2 筛选出的靶点输入STRING（https://string-db.org） 平台，选择“Homo sapiens”，置信度设为 0.7，获得蛋白互作关系。然后导入Cytoscape-3.7.2 中,生成PPI 网络图，以节点度值超过其中位数值、BetweennessCentrality 大于中位数值为标准筛选出重要靶点。

1.5 GO 与 KEGG 富集分析

将上述1.4 的重要靶点导入Metascape（http://metascape.org/）平台分析，选择“Homo sapiens”，进行GO 和 KEGG 通路富集分析。

1.6 筛选鸦胆子作用于NSCLC 的核心靶点

将1.4 筛选出的重要靶点导入GEPIA,http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)数据库，选择“总体生存”和“中位数”作为筛选条件。P＜ 0.05 和P(HR) ＜ 0.05 作为LUAD 数据集的显著性阈值来筛选鸦胆子作用于NSCLC 的核心靶点。

1.7 化合物-靶点-通路图

通过R 语言画出鸦胆子化合物-靶点-通路关系图。

2 结果

2.1 鸦胆子活性成分筛选和疾病靶点筛选

通过已有文献报道及TCMSP 以“OB≥30%、DL≥0.18”筛选出鸦胆子活性化合物共16 种。删除化合物对应的靶点重复值后进行合并，共获得靶点230个。通过GenCards 等数据库收集到NSCLC 相关靶点共3813个，将鸦胆子和疾病靶点进行映射取交集共得到152个交叉靶点，即鸦胆子治疗NSCLC 靶点，见图1。

图1 鸦胆子和肺癌交集靶点的韦恩图

2.2 构建与分析鸦胆子活性成分-靶点网络

如图2，成功构建了鸦胆子活性成分-靶点网络。其中，自由度排名前十的鸦胆子活性成分见表1。

表1 鸦胆子主要活性成分

图2 鸦胆子活性成分-疾病靶点网络图

2.3 PPI 网络构建与分析

将鸦胆子治疗NSCLC 的152个潜在靶点导入STRING 平台,根据置信度＞0.7 进行筛选，随后导入Cytoscape-3.7.2 将结果可视化。以BetweennessCentrality ＞中位数值（0.00264092），degree ＞中位数值（5）为参数筛选出重要靶点共50个，具体见图3。

图3 鸦胆子PPI 网络图

2.4 GO 与KEGG 信号通路分析

对鸦胆子的50个重要靶点进行GO 和 KEGG 富集分析，其中生物过程主要包括蛋白质磷酸化、调控细胞周期等，细胞成分主要包括周期蛋白依赖的蛋白激酶、转移酶复合体等，分子功能主要包括蛋白丝氨酸激酶活性等。KEGG 分析显示鸦胆子治疗NSCLC 涉及多种信号通路，主要包括：VEGF 和PI3KAkt 信号通路等，见图4。

图4 鸦胆子富集分析网络图

2.5 鸦胆子成分-NSCLC 治疗靶点-通路网络图的构建

利用Cytoscape 建立鸦胆子治疗NSCLC 的活性成分-靶点-通路网络。此网络由73个节点和364条边组成(图5)。

图5 鸦胆子治疗NSCLC 成分-靶点-通路图

2.6 鸦胆子核心靶点分析

在GEPIA 数据库中搜索39个重要靶点,通过总体生存率筛选出了14个核心靶点(表2)。然后，我们绘制了鸦胆子治疗非小细胞肺癌化合物-靶标-通路的关系图（图6）。

表2 鸦胆子核心靶点分析

接上 表2 鸦胆子核心靶点分析

接上 表2 鸦胆子核心靶点分析

图6 鸦胆子治疗NSCLC 成分-核心靶点-通路分析图

2.7 鸦胆子治疗NSCLC 成分-核心靶点-通路分析

我们绘制出鸦胆子治疗NSCLC 成分-核心靶点-通路图，即鸦胆子8 种化合物通过11个核心靶点作用于前20个通路上（通路上没有富集的靶点被剔除）。

3 讨论

本研究通过网络药理学的方法分析了鸦胆子治疗NSCLC 的作用机制。通过活性成分-疾病靶点的网络分析显示鸦胆子共有16 种化合物。根据鸦胆子治疗NSCLC 成分-靶点-通路图，鸦胆子同一化合物能调控不同靶点，而同一靶点又能调控不同通路，其中木犀草素、鸦胆亭和鸦胆醇共同靶向CDK1 和PTGS2，主要作用于VEGF 信号通路，从而抑制肺癌血管生成。

木犀草素是一种多酚类植物黄酮类化合物，研究表明木犀草素具有良好的抗肿瘤活性[13,14]，通过多种机制抑制癌细胞的生长，如刺激肿瘤细胞凋亡、抑制细胞复制、肿瘤生长、提高耐药性、防止癌细胞侵入和转移[15]。研究表明木犀草素能显著抑制kras 突变型肺癌的增殖，并下调IFN-γ诱导的PD-L1 表达，从而提高kras 突变肺癌的抗肿瘤免疫能力[16]。Zhang M 等[17]通过体内外实验发现木犀草素能通过下调LIMK1 抑制肺癌细胞增殖。Wu B 等[18]发现木犀草素单独或联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）均可降低A549 细胞和H1975 细胞的活力，增加细胞凋亡。鸦胆亭 (bruceantin,BCT)是鸦胆子中的主要有效成分，1973年首次被发现可以从鸦胆子中分离,并具有抗白血病[19]和抗肿瘤作用[20]。研究发现[21]鸦胆亭能上调miR-29a-3p 抑制NSCLC H1299 细胞的增殖、迁移与侵袭。查阅文献发现有关鸦胆亭治疗NSCLC 的研究比较鲜见，其作用于NSCLC 的机制值得进一步深入探讨。有研究表明鸦胆醇是一种新型的STAT3 抑制剂，在结肠癌体外和体内实验中能抗肿瘤[22]。

细胞周期依赖性激酶1（Cyclin-dependent kinases 1,CDK1）参与细胞周期、有丝分裂等过程[23]。研究发现CDK1 是肺腺癌潜在预后分子标志物[24]，而miR-496 能降低CDK1 的表达使肺癌A549 细胞凋亡[25]，同时Chk1 抑制剂在体内外实验中对小细胞肺癌具有抗肿瘤作用，并能延缓其耐药[26]。环氧合酶-2（COX-2）是一种诱导型酶，由PTGS2 基因编码，被认为是“快速反应基因”[27]。研究发现COX-2 在肺腺癌中高表达[28]，而COX-2 抑制剂能抑制肺癌细胞增殖，促肺癌细胞凋亡[29]。

GO 富集分析显示，鸦胆子的作用靶点与蛋白质磷酸化、调控细胞周期等生物过程，蛋白丝氨酸激酶活性等分子功能及周期蛋白依赖的蛋白激酶、转移酶复合体等细胞成分有关。KEGG 结果显示，鸦胆子治疗 NSCLC 涉及多种信号通路。其中，在癌症发生发展进程中，VEGF 在肿瘤血管生成和血管生成依赖性转移中起着关键作用[30]。研究发现癌细胞分泌VEGF 的方式为自分泌和旁分泌，激活癌细胞中的VEGF/VEGFR 信号通路达到促进肿瘤生长的目的[31]。此外，VEGF 在肺腺癌患者中高表达，表明其预后较差[32]，在临床上，抗血管生成药物能抑制NSCLC，联合化疗、靶向或免疫治疗等可发挥协同作用[33]。

本研究通过网络药理学，筛选出鸦胆子中的主要活性成分，构建了活性成分-疾病靶点之间的网络图，并得出了鸦胆子治疗 NSCLC 潜在的作用靶点及相关通路，为进一步的试验验证和临床治疗方面提供了理论基础。然而本研究的数据主要从各个平台数据库中获取，具有一定的片面性和局限性，故具体结果仍需进一步实验验证。