葛根芩连汤有效成分对黄芩苷在Caco-2细胞模型中吸收转运的影响

顾青青， 邵以诺， 安 叡， 王 跃， 张艺竹， 王新宏

（上海中医药大学，上海201203）

葛根芩连汤有效成分对黄芩苷在Caco-2细胞模型中吸收转运的影响

顾青青， 邵以诺#， 安 叡*， 王 跃， 张艺竹， 王新宏

（上海中医药大学，上海201203）

目的采用LC-MS/MS法研究葛根芩连汤（葛根、黄芩、黄连、甘草）有效成分对黄芩苷在Caco-2细胞模型中吸收转运的影响。方法建立Caco-2细胞模型，采用细胞摄取实验和细胞转运实验评价多药耐药相关蛋白（MRP2）的功能。结果摄取实验中，黄芩苷的摄取量在60min基本达到饱和 ［（0.68±0.07）ng/μg］，加入MRP2抑制剂MK-571之后，黄芩苷的摄取量显著升高 ［（1.10±0.02）ng/μg，P＜0.01］，而P-gp转运蛋白抑制剂维拉帕米无此效果。配伍葛根素能提高黄芩苷的摄取量 （P＜0.05），而小檗碱、甘草苷的作用有统计学意义。细胞转运实验的结果表明，加入MRP2转运蛋白抑制剂后能增加黄芩苷从肠腔侧 （AP）到基底侧 （BL）侧的转运。配伍葛根素、甘草苷后能促进黄芩苷从AP到BL侧的转运，小檗碱无明显影响。结论MRP2转运蛋白调控Caco-2细胞摄取吸收黄芩苷，推测其可能为MRP2转运蛋白的底物。葛根素可使在Caco-2细胞中黄芩苷被外排的量减少，从而增加黄芩苷的吸收量。

葛根芩连汤；Caco-2；转运；多药耐药相关蛋白 （MRP2）；黄芩苷；葛根素；甘草苷；小檗碱

KEY WORDS：Gegen Qinlian Decoction；Caco-2 cells；transport；multidrug resistance-associated protein 2（MRP2）；baicalin；puerarin；liquiritin；berberine

葛根芩连汤记载于张仲景的 《伤寒论·太阳病上篇》，全方有清泄里热，解肌散邪之功效，由葛根、黄芩、黄连、甘草四味药组成，黄酮、生物碱是其主要的药理活性成分［1］。葛根芩连汤经口服给药，其有效成分必先经过肠道的吸收才能进入体内发挥药效。

Caco-2（Mancolon carcinoma cell lines）细胞模型来源于人类结肠癌细胞，其结构和生化特性类似于人小肠上皮细胞，已作为公认的研究药物肠吸收机制的有效工具之一，且能预测药物体内吸收、代谢和药物相互作用［2］。药物在吸收、分布、排泄过程中的跨膜转运均受到药物转运蛋白的影响，目前研究比较多的是P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2），其利用ATP分解产生的能量将细胞内的药物外排，起着外向型转运泵作用，在药物的吸收中起着重要的作用［3］。Caco-2细胞能够表达MRP2转运蛋白，且在一定培养条件下，Caco-2细胞模型稳定性、重复性较好。

黄芩苷是中药黄芩中的主要活性成分，有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性。有文献报道［4-5］，黄芩苷在肠道中的吸收受MRP2转运蛋白的调控。课题组前期研究表明，在葛根芩连汤全方中的黄芩苷的吸收要好于其他配伍组［6］，且葛根的作用强于甘草［7］，为了推测葛根芩连汤中某些成分可能起到类似MRP2转运蛋白抑制剂的作用，通过抑制MRP2转运蛋白对黄芩苷的外排作用，使黄芩苷的吸收增加。本研究运用LC-MS/MS法，研究葛根芩连汤有效成分对黄芩苷在Caco-2细胞模型中吸收转运的影响，并采用Caco-2细胞模型研究葛根芩连汤中黄芩苷及其他活性成分同MRP2转运蛋白的关系，希冀从MRP2转运蛋白的角度阐释复方配伍的规律。

1 材料

1.1 药物与试剂 葛根素 （批号 110752-200912）、黄芩苷 （批号110715-201117）、盐酸小檗碱 （批号 110713-201212）、甘草苷 （批号111610-201106）、盐酸维拉帕米 （批号100223-200102）、卡马西平 （批号100142-201105）均购于中国食品药品检定研究院；DMEM高糖培养液（Hyclone，美国）；胎牛血清（Hyclone，美国）；非必需氨基酸，青霉素-链霉素双抗液 （Gibco公司，美国），胰蛋白酶Trypsin-EDTA（Gibco，美国）；MTT，MK-571（Sigma公司，美国）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒 （碧云天生物技术研究所）；HBSS缓冲液（Hanks Balanced Salt Solutions，Gibco by life technologies，美国）、PBS缓冲液（Phosphate Buffered Saline，上海康稳生物科技有限公司）；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器 二氧化碳细胞培养箱（Binder，德国）；洁净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰技术有限公司）；Millicell-ERS跨膜电阻仪（Millipore，美国）；倒置光学显微镜 （Nikon，日本）；高速冷冻离心机 （Eppendorf Centrifuge5424R，德国）；AL104电子天平 （梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；酶标仪（Synery HY，美国）；Agilent1290液相色谱仪（Agilent，美国），Agilent 6460 Triple Quad LC/MS三重串联四级杆质谱仪（Agilent，美国）等。

1.3 细胞株 Caco-2细胞株购自于中国科学院上海细胞资源中心（原代来源于ATCC：American type culture collection），本研究过程中所有使用的Caco-2细胞均在25～35代之间。

2 方法

2.1 溶液的配置 标准品贮备液配制：分别取黄芩苷、葛根素、盐酸小檗碱、甘草苷、盐酸维拉帕米、MK-571适量，精密称定，用 （DMSO）溶解，并用HBSS缓冲液溶解配置成质量浓度分别为223、208、185、209、1 140、643μg/m L的对照品贮备液，备用。使用时用HBSS缓冲液稀释至所需浓度，并使DMSO浓度低于0.1%。

给药溶液配制：分别取上述不同标准贮备液，配成下述不同配伍组给药溶液，20μmol/L的黄芩苷溶液，20μmol/L的黄芩苷和20μmol/L的葛根素溶液，20μmol/L的黄芩苷和20μmol/L的小檗碱溶液，20μmol/L的黄芩苷和20μmol/L的甘草苷溶液，20μmol/L的黄芩苷和100μmol/L的维拉帕米溶液，20μmol/L的黄芩苷和50μmol/L的MK-571溶液。

细胞培养液的配置：无菌的DMEM高糖培养液中加入胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素-链霉素双抗液，所占比分别为10%、1%、1%，混合均匀，即得，4℃冷藏备用。

2.2 色谱和质谱条件

2.2.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱（4.6 mm×50 mm，2.7-Micron）；流动相水（A）-甲醇（B）梯度洗脱（0 min～2.5 min，B：50% ～95%；2.5 min～4 min，B：95% ～95%；体积流量0.3 m L/min，柱温室温，进样量5μL。

2.2.2 质谱条件 质谱仪采用大气压电喷雾电离源 （ESI），干燥气温度设定为350℃，干燥气体积流量为10 L/min，雾化器压力为275.8 kPa，毛细管电压为4 000 V。选择正离子扫描方式，多反应检测模式 （MRM）测定。其他参数如表1所示。

表1 质谱选择通道及相关参数Tab.1 M ass spectrometry ionization channels and relevant param eters

2.2.3 标准品溶液的制备 将黄芩苷和卡马西平标准品用五氧化二磷干燥48 h，取适量，精密称定，用甲醇溶解，得1.12μg/mL的黄芩苷对照品溶液，0.983μg/mL的卡马西平内标溶液，4℃保存备用。

2.2.4 样品处理 将取得的细胞样品加入等体积的乙腈，涡旋混匀，高速离心，取上清液过膜后按“2.2.2”项下确定的质谱条件进样检测。

2.3 Caco-2细胞模型的建立 按文献［8］方法，将购买的细胞株加入胰蛋白酶消化，低速离心除去残留胰酶后接种至3个培养瓶中，加入DMEM高糖培养液 （含10%牛血清、1%抗溶液、1%需氨基酸溶液），放入5%CO2细胞培养箱中培养 （37℃恒温），隔天吸走所有培养液，更换新鲜的培养液。6～7 d后，在倒置显微镜中观察，如果达到80% ～90%融合时，使用胰酶消化，按照一定比例，或继续传代培养，或进行相关实验。进行实验的细胞在25～35代之间。

2.4 MTT实验 取Caco-2细胞，加入胰酶消化，1 500 r/min低速离心5 min，上清液弃去。加入2 mL培养液，用移液器轻轻吹打，将细胞分散均匀。使用细胞计数器将细胞混悬液计数，然后将其稀释到1×105个/mL，按每孔100μL接种于96孔培养板上。将接种好细胞的96孔板放入5%CO2细胞培养箱，培养24 h后，分别更换含有不同浓

2.5 细胞摄取实验 取Caco-2细胞，加入胰酶消化，1 500 r/min低速离心5 min，上清液弃去。加入2 mL培养液，将细胞分散均匀。使用细胞计数器将细胞混悬液计数，然后将其稀释到1×105个/m L，将稀释的细胞混悬液接种到24孔板上，每孔1 mL。隔天更换新鲜的培养液，6～7 d，倒置显微镜观察细胞达到100%融合后进行摄取实验。用PBS缓冲液将细胞洗涤3次，洗去剩余的培养液。然后加入1 mL含有不同浓度黄芩苷的培养液，作用一段时间后，吸去所有的药液，加入1 mL PBS缓冲液，清洗残余的药液。最后加入1 m L的超纯水，-80℃反复冻融3次，超声30 min，以破碎细胞。混匀后取细胞悬液，15 000 r/min，4℃冷冻离心15 min，并取上清液5μL进样分析，按 “2.2.2”项下条件检测黄芩苷的含量。未过滤细胞悬液以考马斯亮蓝法定量蛋白［9］。

细胞摄取量的计算公式为：度的药液，每组设置3个平行孔。同时设置阴性对照组，即接种细胞后加空白培养液；调零组，即不接种细胞只加入空白培养液。将加好药液的96孔板放入5%CO2培养箱中。24 h后取出，每孔加入MTT溶液20μL，继续放入5%CO2培养箱，4 h后反应完全，移去所有液体，每孔加入DMSO溶液150μL，振荡2 min，使形成的紫色结晶充分溶解，MTT实验样品直接使用酶标仪在495 nm处检测其光吸收值。细胞存活率计算公式为：

2.6 细胞转运实验 将Caco-2细胞用胰酶消化，低速离心除去残留的胰酶。用细胞计数板计数，将细胞混悬液稀释到5×105个/m L，然后把细胞接种到Transwell 24培养板中的Millicell小室中。24孔培养板隔天换液，21 d后，用Millicell-ERS跨膜电阻仪检测跨膜电阻，跨膜电阻值大于 500 Ω·cm2，则可用于细胞转运实验。

首先用HBSS缓冲液将细胞洗涤3次，最后加入HBSS缓冲液，然后将24孔培养板置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中孵育30 min，除去所有的HBSS缓冲液。取400μL溶有不同配伍组的药液，加入Transwell 24培养板的Apical（肠腔侧，AP）或Basolateral（基底侧，BL）作供给池，其对应的BL侧或AP侧加入600μL空白HBSS缓冲液作为接收池，置于37℃培养箱中培养，分别于给药后15、30、45、60、90、120 min时，从接收池取样各100μL，同时补足同体积预热至37℃空白HBSS缓冲液。实验平行做3组。

将细胞转运实验的样品溶液加入等体积乙腈，涡旋混匀，15 000 r/min，并取5μL上清液进样分析，按 “2.2”项下条件检测黄芩苷的含量。

2.7 参数的计算

2.7.1 表观渗透系数 药物的表观渗透系数（apparent permeability）Papp代表药物转运能力的大小。它的计算公式为：

Papp=（dQ/dt）（1/S）（1/C0）

其中，Q表示累计转运量，表示dQ/dt累计转运量和时间曲线的斜率，S是转运膜的面积（0.6 cm2），C0是药物的初始浓度，Papp的单位常用为cm/h或cm/s；Papp（BL-AP）是药物BL侧到AP侧的分泌表观渗透系数，Papp（AP-BL）是药物从AP侧倒BL侧的吸收表观渗透系数。

2.7.2 外排比率 药物外排率［10］（Efflux Ratio，ER）用Papp（BL-AP）与Papp（AP-BL）的比值表示，代表药物净往外排的能力，预测外排作用引起的药物口服吸收减弱的程度。公式如下：

2.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理，用One-way ANOAY方差分析，各组间数据比较采用LSD、S-N-K检验，P＜0.05认为具有统计学意义，数据以表示。

3 结果

3.1 细胞毒性试验结果 MTT实验结果见图1、图2，各配伍组的细胞存活率均在95%以上，光学显微镜下观察，各配伍组细胞间紧密连接结构完好，未见明显损伤，表明建立的Caco-2细胞模型稳定可靠，在预给药浓度下，成分之间的配伍不会对细胞活性产生显著性损伤。

图1 黄芩苷及其各配伍组的细胞存活率Fig.1 Cell viability of baicalin and its com patibility groups

图2 光学显微镜下的不同组别的Caco-2细胞形态Fig.2 Different groups of morphology under opticalm icroscope in Caco-2 cell

3.2 方法学研究

3.2.1 色谱条件 在 “2.2.2”项条件检测下，分别进样空白HBSS溶液，对照品溶液，样品溶液，结果表明，黄芩苷的检测灵敏度高，且溶液中无杂质峰干扰样品的测定，见图3。

3.2.2 标准曲线的建立 精密吸取不同体积的黄芩苷对照贮备液，用HBSS缓冲液稀释，使其质量浓度分别为0.056、0.112、0.280、0.560、0.840 μg/mL，取系列标准品溶液各200μL，加入20μL卡马西平溶液 （0.983μg/m L），取5μL进样分析，以质量浓度为横坐标，黄芩苷的峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，进行线性回归，得到黄芩苷在0.056～1.12μg/mL线性关系良好，线性回归方程为：Y=0.000 8X+0.130 1，r=0.999 6。

3.2.3 精密度试验 精密移取对照品溶液，加入内标，混匀后重复进样6次，测得峰面积，计算峰面积 （Ai）与内标峰面积 （A s）比值Y，结果表明，黄芩苷Y值的RSD值为1.3%，符合测定要求。

3.2.4 稳定性试验 取同一样品溶液，加入内标，混匀后分别在0、2、4、8、12、24 h进样检测，测得峰面积，计算峰面积 （Ai）与内标峰面积（A s）比值Y，结果表明，黄芩苷Y值的RSD值为

图3 专属性实验LC-MS/MS色谱图Fig.3 LC-MS/MS chrom atogram s of the specificity tests

5.1%，表明样品在24 h内稳定。

3.2.5 回收率试验 取已知浓度的样品溶液，分别加入低、中、高3种浓度的对照品溶液适量，按“2.2.4”项下的方法处理，每200μL样品加入20μL卡马西平内标溶液，按确定的质谱条件进样检测，计算各组平均回收率，结果显示，平均回收率为99.5%，符合测定要求。

3.3 细胞摄取实验结果 黄芩苷在黄芩苷组、黄芩苷和MK571配伍组、黄芩苷和维拉帕米配伍组、黄芩苷和葛根素配伍组、黄芩苷和小檗碱配伍组以及黄芩苷和甘草苷配伍组中的摄取量分别为（0.68±0.07）、 （1.10±0.02）、 （0.73±0.08）、（0.91±0.04）、 （0.84±0.08）、 （0.73±0.04）ng/μg。同黄芩苷组相比，加入P-gp转运蛋白抑制剂维拉帕米的配伍组未能提高黄芩苷的摄取量，而加入MRP2转运蛋白抑制剂MK-571能够显著增加黄芩苷的摄取量 （P＜0.05），初步证实黄芩苷是MRP2转运蛋白的底物。葛根素、小檗碱能够提高黄芩苷在Caco-2细胞中摄取量，其中葛根素有显著性差异 （P＜0.05）见图4。

图4 黄芩苷在不同物质的作用下的摄取量Fig.4 Baicalin intake in differentmaterial actions

3.4 细胞转运实验结果 转运实验结果 （图5）所示，所有组别中黄芩苷的Papp（BL-AP）值之间无显著性差异，表明黄芩苷的外排量具有一定的饱和性和方向性，这与Teruaki Akao［11］等人研究黄芩苷在Caco-2细胞中发现转运和分泌依靠MRP2的作用相关，且主要在 AP侧。各组黄芩苷的Papp（AP-BL）值分别为［（0.53±0.05）、 （1.55± 0.07）、 （0.61±0.08）、 （1.04±0.14）、 （0.66± 0.10）、（0.93±0.07）］×10-6cm/s，MRP2转运蛋白抑制剂MK-571能够显著性增加黄芩苷的Papp（AP-BL）值，而P-gp转运蛋白抑制剂维拉帕米对黄芩苷Papp（AP-BL）值的增加无显著性影响，推测黄芩苷在Caco-2细胞上的转运可能未涉及P-gp转运蛋白的外排作用。葛根素和甘草苷均能提高黄芩苷Papp（AP-BL）的值 （P＜0.05），推测葛根素、甘草苷可能为MRP2转运蛋白抑制剂，可促进黄芩苷的吸收。

图5 黄芩苷在不同配伍组中的Papp值Fig.5 Papp values of baicalin in different compatibility groups

表2 黄芩苷在不同组别中的ER值Tab.2 ER value of baicalin in d ifferent groups

表2 黄芩苷在不同组别中的ER值Tab.2 ER value of baicalin in d ifferent groups

注：与黄芩苷组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；ER值为Papp（BL-AP）与Papp（AP-BL）的比

组别P app（AP-BL）/（×10-6cm·s-1） ER值P app（BL-AP）/（×10-6cm·s-1）0.53±0.05 0.86±0.39 1.62黄芩苷+MK-571 1.54±0.06** 0.84±0.53 0.55黄芩苷+维拉帕米 0.60±0.07 0.87±0.04 1.43黄芩苷+葛根素 1.04±0.13* 0.81±0.10 0.78黄芩苷+小檗碱 0.65±0.09 0.89±0.06 1.36黄芩苷+甘草苷 0.93±0.06*黄芩苷0.85±0.09 0.92

本研究各组的ER值如表2所示，分别为1.62、0.55、1.43、0.78、1.36、0.92。在MRP2转运蛋白抑制剂MK-571的作用下，黄芩苷在Caco-2细胞中的ER值能够从1.62降低到0.55，降低幅度大于50%，葛根素配伍组降低程度与MK-571配伍组类似，这两个配伍组与黄芩苷组相比，均有显著性差异，其他配伍组降低程度不明显。

4 讨论

本研究建立的黄芩苷成分的LC-MS/MS分析方法，可实现组分的高效，快速检测。方法学考察表明该检测方法可用于Caco-2细胞实验样品中黄芩苷含量的测定，精密度、稳定性可靠，可为葛根芩连汤肠吸收特征的研究提供可靠、高效的分析方法。

MTT实验结果表明建立的Caco-2细胞模型稳定可靠，在预给药浓度下，成分之间的配伍不会对细胞活性产生显著性损伤。光学显微镜下，细胞之间的紧密连接结构完好，细胞生长旺盛，无明显裂隙。

摄取实验中，黄芩苷的摄取量在60 min基本达到饱和，加入MRP2抑制剂MK-571之后，黄芩苷的摄取量显著升高（P＜0.01），而P-gp转运蛋白抑制剂维拉帕米无此效果。初步说明黄芩苷能被Caco-2细胞摄取，是MRP2转运蛋白的底物，黄芩苷在Caco-2细胞上的跨膜转运受到MRP2转运蛋白的调控。配伍其他成分后，葛根素能提高黄芩苷的摄取量 （P＜0.05）。

细胞转运实验的结果表明，加入MRP2转运蛋白抑制剂后能增加黄芩苷从AP到BL侧的转运。配伍葛根素、甘草苷后能促进黄芩苷从AP到BL侧的转运，小檗碱无明显影响。综合摄取实验和转运实验的结果推测，黄芩苷为MRP2转运蛋白的底物，其吸收受MRP2转运蛋白的调控。葛根素能够抑制MRP2转运蛋白对黄芩苷的外排作用，使黄芩苷被Caco-2细胞外排的量减少，黄芩苷吸收量增加。研究结果从MRP2转运蛋白角度初步阐明了课题组前期研究结果，即在葛根芩连汤全方中的黄芩苷的吸收要好于其他配伍组，葛根促进其吸收的作用较强的机理。

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Influence of active ingredients in Gegen Qinlian Decoction on uptake and transport of baicalin in Caco-2 cellm odel

GU Qing-qing， SHAO Yi-nuo#， AN Rui*， WANG Yue， ZHANG Yi-Zhu， WANG Xin-hong

（Shanghai University of TCM，Shanghai201203，China）

AIMTo study the influence of the active ingredients in Gegen Qinlian Decoction（Puerariae lobatae Radix，Scutellariae Radix，CoptidisRhizoma，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）on the transporting properties of baicalin across Caco-2 cellmodel with LC-MS/MS.METHODSThe established Caco-2 cellmodel was employed to evaluate the functionsofmultidrug resistance-associated protein 2（MRP2）by cell uptake and cell transport experiments.RESULTSThe results of cell uptake experiments showed that the saturated uptake of baicalin could reach（0.68±0.07）ng/μg in 60 min.MRP2 inhibitor MK-571 could enhance the uptake of baicalin up to（1.10±0.02）ng/μg（P＜0.01），while P-gp inhibitor Verapamil did not have similar effect.After the compatibility experiments，puerarin increased the uptake of baicalin（P＜0.05），whereas liquiritin was not of statistical significance.The cell transfer experiment indicated the addition of MRP2 inhibitor could increase the transport of baicalin from apical side to basolateral side.The combination of puerarin and liquiritin enhanced the transport of baicalin from apicalside to basolateral side，butberberine presented no effect.CONCLUTIONWe could speculate that baicalinmightbe MRP2 transporter substrate in Caco-2 cell based on the experiment data and the fact that MRP2 transporter increases the absorption of baicalin.Puerarin can decrease the efflux of baicalin from the Caco-2 cells，thus increasing its uptake.

R85.5

A

1001-1528（2015）04-0694-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.001

2014-04-15

顾青青 （1989—），女，硕士生，研究方向为药物分析与体内过程研究。Tel：（021）51322450，E-mail：gqq19890428qq@ 126.com

#邵以诺：共同第一作者

*通信作者：安 叡 （1973—），女，博士，副教授，研究方向为药物分析与体内过程研究。Tel：（021）51322183，E-mail：anruimw @126.com