丹蛭降糖胶囊对波动高糖诱导的INS-1细胞凋亡和胰岛素分泌的影响

郑书国， 赵梦秋， 吴元洁， 任尤楠

（1.皖南医学院药理教研室，安徽 芜湖 241002；2.安徽中医药大学中医基础学教研室，安徽 合肥230038）

丹蛭降糖胶囊对波动高糖诱导的INS-1细胞凋亡和胰岛素分泌的影响

郑书国1， 赵梦秋1， 吴元洁2*， 任尤楠1

（1.皖南医学院药理教研室，安徽 芜湖 241002；2.安徽中医药大学中医基础学教研室，安徽 合肥230038）

糖尿病是由于绝对或相对胰岛素分泌不足引起的以高血糖为主要特征的代谢性疾病。长期高血糖一方面可引起各种急慢性并发症，另一方面又发出胰岛素需求信号，短期内可使胰岛B细胞代偿性分泌更多胰岛素，长期则引起B细胞功能衰竭，胰岛素分泌进一步减少，血糖进一步升高，形成恶性循环。胰岛B细胞数量减少及功能缺陷是胰岛功能衰竭的主要原因，而高血糖引起的B细胞凋亡则是导致细胞数量减少的主要机制［1］。临床资料显示，由于存在胰岛素抵抗和胰岛功能缺陷，加之饮食控制不佳、用药不当等原因，糖尿病患者常出现明显血糖波动，表现为餐后高血糖及降糖药物引发的低血糖［2］。大量研究表明，波动高血糖较持续性高血糖更易诱导胰岛B细胞凋亡，加重胰岛功能损伤［3］，且血糖波动水平可作为评价糖尿病患者血糖控制情况和预测并发症风险的可靠指标［4］。因此，抑制波动血糖诱导的胰岛功能损伤和B细胞凋亡，是预防和减轻糖尿病慢性并发症的重要措施。

丹蛭降糖胶囊由丹皮、太子参、生地黄、水蛭等组成，具有降低血糖、改善胰岛B细胞功能之效，临床主要用于治疗2型糖尿病，但对其改善糖尿病确切机制目前仍未明确。本研究应用体外培养的大鼠胰岛素瘤细胞株 （INS-1），采用血清药理学方法观察丹蛭降糖胶囊对波动高糖诱导的INS-1细胞凋亡和胰岛素分泌功能的影响，以进一步探讨其改善糖尿病作用机制，为临床用于防治糖尿病提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药品与试剂 Wistar大鼠购于南京青龙山动物繁殖场 （合格证号SCXK2009-0001）；丹蛭降糖胶囊由安徽中医药大学附属医院药剂科提供；INS-1细胞株购于中国典型培养物保藏中心；RPMI 1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；抗胰十二指肠同源盒基因-1（PDX-1）抗体 （Abcam公司）；细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博公司）；β-actin抗体、二抗、胰酶、ECL试剂、超氧化物歧化酶 （SOD）、总抗氧化能力 （TAC）检测试剂盒等 （碧云天生物技术研究所）；其它试剂均为分析纯。

1.2 含药血清制备 Wistar大鼠30只，随机分为3组，每组10只。除对照组外，其余2组每天灌胃给予高、低剂量丹蛭降糖胶囊 （6.4 g/kg、3.2 g/kg），分2次给药，连续7 d。末次给药后2 h，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，无菌条件下分离血清，56℃水浴灭活30 min，-80℃保存备用。

1.3 INS-1细胞培养 INS-1细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中（11.1 mmol/L葡萄糖，100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，1 mmol/L丙酮酸钠，50μmol/Lβ-巯基乙醇），37℃、5%CO2、饱和空气湿度培养，待细胞生长至近融合时，0.25%胰酶消化后传代培养。

1.4 INS-1细胞活性检测 生长近融合的INS-1细胞胰酶消化后按2×104个/孔接种于96孔培养板，24 h后弃培养液，PBS洗涤后加入新鲜培养液。细胞随机分为正常对照组、波动高糖组、空白血清组和丹蛭降糖胶囊高、低剂量组。丹蛭降糖胶囊高、低剂量组分别加入相应含药血清 （终浓度10%），空白血清组加入对照血清 （终浓度10%），孵育24 h。除正常对照组外，其余各组均加入高浓度葡萄糖（终浓度33.3 mmol/L），孵育12 h，更换为普通浓度葡萄糖 （11.1 mmol/L）［5］，持续12 h，连续3 d，MTT法测定细胞活性。

1.5 INS-1细胞胰岛素释放试验［6］生长近融合的INS-1细胞胰酶消化后按2×105个/孔接种于24孔培养板，细胞分组及药物处理同上。弃培养液，PBS洗涤，加入含5.6 mmol/L葡萄糖的Hanks液预孵30 min，再分别更换为含5.6 mmol/L及16.7 mmol/L葡萄糖的Hanks液，37℃各孵育1 h，分别收集细胞上清液，ELISA法测定胰岛素含量。

1.6 PDX-1蛋白表达检测 PDX-1蛋白表达采用Western blot法检测。生长近融合的INS-1细胞胰酶消化后接种于6孔培养板，细胞分组及处理同上。弃培养液，PBS洗涤后加入RIPA裂解液冰浴裂解细胞，12 000×g离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液混匀后沸水浴变性5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入抗PDX-1和β-actin抗体4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，ECL显色，X光胶片曝光显影，凝胶图像分析仪分析条带光密度，结果以PDX-1/β-actin表示。

1.7 INS-1细胞凋亡检测 生长近融合的INS-1细胞胰酶消化后接种于6孔培养板，24 h后弃培养液，PBS洗涤后加入新鲜培养液。待细胞生长至近融合时按 “1.4”项下分组及药物处理。弃培养液，PBS洗涤后胰酶消化收集细胞，预冷PBS洗涤2次，400μL结合液悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC染色液，混匀后4℃避光孵育15 min，加入10μL PI染色液混匀，4℃避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡水平 （激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

1.8 INS-1细胞内活性氧（ROS）检测 生长近融合的INS-1细胞胰酶消化后接种于6孔培养板，细胞分组及处理同上。弃培养液，PBS洗涤后胰酶消化收集细胞。将细胞悬浮于DCFH-DA溶液中，37℃孵育20 min，PBS洗涤细胞，重悬后流式细胞仪检测荧光强度 （激发波长488 nm，发射波长525 nm），以荧光阳性细胞数和平均荧光强度表示细胞内ROS水平。

1.9 INS-1细胞抗氧化能力检测 生长近融合的INS-1细胞胰酶消化后接种于6孔培养板，细胞分组及处理同上。弃培养液，PBS洗涤后收集细胞，超声细胞破碎仪裂解细胞，12 000×g离心10 min，收集上清液，按试剂盒说明测定细胞总抗氧化能力（TAC）和SOD活性，BCA法测定蛋白含量。

2 结果

2.1 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞活性的影响 由图1可见，暴露于波动高糖72 h后，INS-1细胞活性明显受损 （P＜0.01），而含丹蛭降糖胶囊血清可显著提高细胞活性 （P＜0.01），对照血清对细胞活性无明显影响，提示丹蛭降糖胶囊可有效改善波动高糖诱导的INS-1细胞损伤。

图1 丹蛭降糖胶囊对波动高糖诱导的INS-1细胞活性损伤的影响（，n=8）Fig.1 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on the viability of INS-1 cells exposed to interm ittent high glucose（，n=8）

2.2 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞胰岛素分泌的影响 由图2可见，基础状态下（5.6 mmol/L葡萄糖）INS-1细胞仅有低水平胰岛素分泌，而在加入高浓度葡萄糖（16.7 mmol/L）刺激后，胰岛素分泌量明显增加。当INS-1细胞暴露于波动高糖环境72 h后，基础状态和高浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平均显著下降 （P＜0.01），说明波动高糖明显损伤了INS-1细胞胰岛素分泌功能。与含丹蛭降糖胶囊血清预孵后，INS-1细胞胰岛素分泌能力明显改善 （P＜0.05或P＜0.01），而对照血清对胰岛素分泌无明显影响，提示丹蛭降糖胶囊可有效减轻波动高糖诱导的INS-1细胞胰岛素分泌功能损伤。

图2 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞胰岛素分泌的影响（，n=6）Fig.2 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on insulin secretion in INS-1 cells（，n=6）

2.3 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞凋亡的影响 由图3可见，正常情况下，INS-1细胞凋亡率极低，而暴露于波动高糖环境72 h后，INS-1细胞凋亡率明显增加 （P＜0.01），表现为凋亡早期和凋亡晚期或坏死细胞均显著增多。与含丹蛭降糖胶囊血清预孵24 h后再暴露于波动高糖，细胞凋亡率明显下降（P＜0.05或P＜0.01），而对照血清对INS-1细胞凋亡无明显影响，提示丹蛭降糖胶囊可有效抑制波动高糖诱导的INS-1细胞凋亡。

图3 丹蛭降糖胶囊对波动高糖诱导的INS-1细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on INS-1 cell apoptosis induced by interm ittent high glucose

2.4 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞PDX-1蛋白表达的影响 由图4可见，暴露于波动高糖72 h后，INS-1细胞PDX-1表达水平明显下降，而与丹蛭降糖降囊含药血清预孵能明显增加PDX-1蛋白表达水平，这一作用与丹蛭降糖降囊增加INS-1细胞胰岛素分泌和抑制细胞凋亡作用一致，提示丹蛭降糖降囊对INS-1细胞的保护作用与上调PDX-1蛋白表达有关。

2.5 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞内ROS的影响

由图5可见，正常情况下INS-1细胞荧光阳性率及平均荧光强度均较低，而暴露于波动高糖环境72 h后，二者均显著升高 （P＜0.01），提示波动高糖可诱导细胞内ROS水平明显升高。与含丹蛭降糖胶囊血清预孵24 h再暴露于波动高糖，细胞平均荧光强度及阳性细胞百分率均显著降低 （P＜0.05或P＜0.01），而对照血清对二者均无明显影响，提示丹蛭降糖胶囊可显著降低细胞内ROS水平。

2.6 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞抗氧化能力的影响 由表1可见，暴露于波动高糖72 h后，INS-1细胞内SOD活性和总抗氧化能力均明显下降 （P＜ 0.01），这一结果与波动高糖孵育后细胞内ROS水平显著升高一致。与丹蛭降糖胶囊预孵后，细胞总抗氧化能力和SOD活性均明显升高，提示丹蛭降糖胶囊可显著提高INS-1细胞抗氧化能力，降低细胞内ROS水平。

图4 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞PDX-1蛋白表达的影响（，n=4）Fig.4 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on PDX-1 expression in INS-1 cells（，n=4）

图5 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞内ROS水平的影响（，n=4）Fig.5 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on intracellular ROS in INS-1 cells（，n=4）

表1 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞TAC和SOD活性的影响（，n=6）Tab.1 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on TAC and SOD activity in INS-1 cells（，n=6）

表1 丹蛭降糖胶囊对INS-1细胞TAC和SOD活性的影响（，n=6）Tab.1 Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on TAC and SOD activity in INS-1 cells（，n=6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与波动高糖组比较，##P＜0.01

组别 SOD/（U/mg prot） TAC/（mmol/mg prot）正常对照组1.42±0.16 1.12±0.14波动高糖组 0.61±0.08** 0.43±0.07**空白血清组 0.63±0.09** 0.47±0.06**丹蛭降糖高 1.14±0.18## 0.98±0.14##丹蛭降糖低 0.97±0.15## 0.82±0.10##

3 讨论

高血糖是糖尿病最主要临床特征之一，长期高血糖可加重胰岛素抵抗和胰岛B细胞损伤，使葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能进一步受损，血糖水平进一步升高，此即葡萄糖毒性作用。近年来研究发现，由于饮食控制不佳、用药方案不当、治疗依从性差等多方面原因，糖尿病患者常在血糖总体水平明显升高的基础上出现血糖波动性增大，也称为血糖漂移［7］。相对于持续高血糖，波动血糖更易引起各种严重并发症，加重胰岛B细胞损伤，且波动性越大，慢性并发症发生率越高、预后越差［8］。因此，有效控制血糖波动或减轻波动血糖所致的胰岛B细胞损伤，是预防糖尿病并发症、改善糖尿病预后的重要措施之一。本研究采用血清药理学方法，观察了丹蛭降糖降囊对INS-1细胞的保护作用。结果显示，暴露于波动高糖72 h后，INS-1细胞活性明显降低，基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力明显下降，而与丹蛭降糖胶囊含药血清预孵后，INS-1细胞活性明显提高，胰岛素分泌功能显著改善，提示丹蛭降糖胶囊可有效减轻波动高糖诱导的INS-1细胞损伤，这可能是丹蛭降糖降囊降低血糖、改善糖尿病的主要机制之一。

大量研究表明，高血糖可诱导氧化应激状态，增加机体ROS产生，而波动性高血糖较持续性高血糖更易诱导机体氧化应激状态［9］，降低血糖波动水平可明显降低2型糖尿病患者机体氧化应激状态［10］。由于胰岛B细胞表达的 （SOD）等抗氧化酶水平相对较低，故胰岛B细胞抗氧化能力较弱，对ROS介导的损伤极为敏感［11］。大量ROS既可直接引起胰岛B细胞氧化损伤，也可通过影响胰岛素合成和分泌的信号转导通路间接损伤胰岛B细胞。胰十二指肠同源盒基因-1（PDX-1）是在胰岛B细胞特异表达的转录调节因子，是胰岛素基因表达和胰岛素释放最主要的激活因子之一。ROS可减少PDX-1 mRNA表达，降低PDX-1与胰岛素启动子结合活性，下调胰岛素mRNA转录，从而导致胰岛素合成和释放减少［12-13］。此外，PDX-1可促进胰岛B细胞增值，抑制其凋亡，提示ROS诱导的B细胞凋亡与减少PDX-1生成有关［14］。本研究结果显示，暴露于波动高糖72 h后，INS-1细胞内ROS水平明显增加，PDX-1蛋白表达水平显著下降，胰岛素释放明显减少，细胞凋亡率显著升高，而与丹蛭降糖降囊含药血清预孵后，细胞内ROS水平显著下降，PDX-1表达和胰岛素释放增加，细胞凋亡率明显降低。由于对照血清对波动高糖诱导的上述变化均无明显影响，提示丹蛭降糖降囊可能通过降低细胞内ROS水平、上调PDX-1蛋白表达而发挥胰岛B细胞保护作用。

前期研究表明，丹蛭降糖降囊各组成药物均有显著抗氧化活性，其复方制剂能明显提高胰腺组织SOD等抗氧化酶活性，减轻胰腺组织氧化损伤［15］。本研究结果也显示，丹蛭降糖降囊能显著提高INS-1细胞SOD活性和总抗氧化能力，提示丹蛭降糖降囊可通过提高INS-1细胞抗氧化能力而减少细胞内ROS水平。此外，丹蛭降糖降囊可显著降低NADPH氧化酶p22phox表达水平［16］，而后者是细胞内源性ROS的主要来源，高血糖尤其是波动高糖可通过激活NADPH氧化酶而增加细胞内ROS水平［17］。这些结果提示，丹蛭胶囊既可通过增强抗氧化酶活性而发挥抗氧化作用，也可通过抑制ROS产生而保护胰岛B细胞免受氧化损伤。

综上所述，丹蛭降糖降囊可有效减轻波动高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡，改善胰岛素分泌功能，其机制与增强INS-1细胞抗氧化能力、降低细胞内ROS水平，进而上调PDX-1蛋白表达有关，这一作用可能是丹蛭降糖降囊降低血糖、改善糖尿病主要机制之一。

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摘要：目的 探讨丹蛭降糖胶囊 （丹皮、太子参、生地黄、水蛭等）对波动高糖诱导的大鼠胰岛素瘤细胞 （INS-1）凋亡和胰岛素分泌功能的影响，并探讨其可能机制。方法 INS-1细胞与丹蛭降糖胶囊含药血清和对照血清预孵24 h后暴露于波动高糖（11.1 mmol/L 12 h，33.3 mmol/L 12 h）72 h。MTT法测定INS-1细胞活性，ELISA法测定胰岛素释放水平，流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内活性氧 （ROS）水平，Western blot法检测胰十二指肠同源盒基因-1（PDX-1）蛋白表达水平，比色法测定细胞总抗氧化能力 （TAC）和超氧化物歧化酶 （SOD）活性。结果 含丹蛭降糖胶囊血清可明显减轻波动高糖诱导的INS-1细胞损伤、凋亡和胰岛素分泌功能障碍 （P＜0.05或P＜0.01），上调PDX-1蛋白表达水平 （P＜0.01），并能显著提高细胞内SOD活性和总抗氧化能力，降低细胞内ROS水平。结论 丹蛭降糖胶囊可有效减轻波动高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡，改善胰岛素分泌功能，其机制与提高细胞抗氧化能力、降低细胞内ROS水平，进而上调PDX-1蛋白表达水平有关。
关键词：丹蛭降糖胶囊；糖尿病；波动高糖；INS-1细胞；活性氧
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1001-1528（2015）04-0722-07
doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.007

Effect of Danzhi Jiangtang Capsules on insulin secretion capacity and apoptosis of INS-1 cell exposed to interm ittent high glucose

ZHENG Shu-guo1， ZHAO Meng-qiu1， WU Yuan-jie2， REN You-nan1
（1.Departmentof Pharmacology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China；2.Departmentof Basic Theory of TraditionalChineseMedicine，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei230038，China）

AIMTo explore the effect of Danzhi Jiangtang Capsules（Moutan Cortex，Pseudostellariae Radix，Rehmanniae Radix，Hirudo，etc）on insulin secretion capacity and apoptosis of INS-1 cells exposed to intermittent high glucose.METHODSFollowing pre-incubation with Danzhi Jiangtang Capsules containing serum and control serum for24 h，INS-1 cellswere exposed to intermittenthigh glucose（IHG，11.1mmol/L 12 h，33.3mmol/L 12 h）for72 h.Cell viability was determined by MTT assay and insulin secretion capacity was evaluated by ELISA. Cell apoptosis and intracellular ROSwere determined by flow cytometry analysis.Protein expression of pancreatic and duodenal homeobox-1（PDX-1）was assayed byWestern-blot.Total antioxidant capacity and SOD activity were assessed by colorimetric assay using commercially available kits.RESULTSPretreatment with Danzhi Jiangtang Capsules containing serum significantly improved IHG-induced INS-1 cell injury and insulin secretion dysfunction（P＜0.05 or P＜0.01），suppressed IHG-induced cell apoptosis，and up-regulated the expression of PDX-1 protein（P＜0.05 or P＜0.01）.Pre-incubation with Danzhi Jiangtang Capsules led to a significantenhancementof antioxidant capacity and reduction of intracellular ROS（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONDanzhi Jiangtang Capsules is capable of suppressing IHG-induced INS-1 cell apoptosis and improving its insulin secretion ca-pacity，whichmightbe attributed to the enhancementof antioxidant capacity and subsequentup-regulation of PDX-1 expression.

Danzhi Jiangtang Capsules；diabetes；intermittent high glucose；INS-1 cells；reactive oxygen species

2014-10-11

国家自然科学基金项目资助 （81102626H2716）

郑书国（1967—），男，博士，副教授，从事药理学教学、研究工作。E-mail：zhengsg2000@163.com

*通信作者：吴元洁 （1973—），女，教授，研究方向为中医药防治糖尿病及其并发症的基础研究。Tel：15155906032，E-mail：anhuiwuyuanjie@126.com