坎地沙坦干预大鼠动脉粥样硬化血管形态的作用

周玉娟，刘莉，刘春颖，曹晓华，陈涛平

（1.河北大学基础医学院，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院，河北 保定 071000）

坎地沙坦干预大鼠动脉粥样硬化血管形态的作用

周玉娟1，刘莉1，刘春颖1，曹晓华2，陈涛平2

（1.河北大学基础医学院，河北 保定 071000；2.河北大学附属医院，河北 保定 071000）

目的探讨坎地沙坦对动脉粥样硬化大鼠血管形态的影响。方法通过给正常大鼠饲喂高脂饲料，建立动脉粥样硬化模型。将50只大鼠随机分为正常组，模型组，坎地沙坦低、中、高剂量组。12周后取相同部位主动脉分别进行固定、染色，在光镜及电镜下进行观察，并测量血管内膜、中膜厚度。结果模型组与正常组相比主动脉出现动脉粥样硬化的形态学改变；与模型组相比坎地沙坦低、中、高剂量组动脉粥样硬化的形态学改变有所减轻。模型组与正常组相比，内膜与中膜厚度显著增加（P＜0.01)；与模型组相比，坎地沙坦中、高剂量组可明显减轻动脉内膜及中膜厚度（P＜0.01)。结论坎地沙坦可减轻大鼠动脉粥样硬化形态学改变，减少血管内膜、中膜的增生。

坎地沙坦；动脉粥样硬化；形态学

本文引用：周玉娟,刘莉,刘春颖,等.坎地沙坦干预大鼠动脉粥样硬化血管形态的作用[J].医学研究与教育,2015,32(3): 6-10,39.

坎地沙坦是选择性血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型（angio-tensinⅡtype1 receptor,AT1）拮抗剂，属于联苯四唑非肽类药物，1998年7月于瑞典首次上市。坎地沙坦作用于AT1受体，因而对于心血管及靶器官有强大作用。坎地沙坦临床主要应用于高血压、心力衰竭，作用于冠心病病理生理的多个环节，是一个具有广泛临床应用前景的药物[1]。采用给大鼠高脂饮食并腹腔注射维生素D3的方法建立动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）模型，观察坎地沙坦对AS大鼠血管形态的影响。

1 材料

1.1 主要药品和试剂

迪沙药业的坎地沙坦，赛尔克生物公司的胆固醇，北京奥博星公司的猪胆酸钠，上海朝晖药业的丙基硫氧嘧啶，由河北大学基础医学院药理学研究生实验室配制的中性甲醛。由河北大学生命科学院电镜室配制的戊二醛固定液。

1.2 主要仪器设备

KD-BM生物包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司），OLYMPUSBX50光学显微镜（日本OLYMPUS公司），H-7500透射电子显微镜（日本日立公司），LEICA RM2126石蜡切片机（德国Leica公司）。

1.3 动物分组和处理

SPF级SD大鼠50只，自由饮食，体质量（197.2±5.6）g，均为雄性，许可证号: SCXK(冀) 2008-1-003，由河北省实验动物中心提供，50只SD大鼠随机分为5组，每组10只：正常对照组，动脉粥样硬化模型组，坎地沙坦高［10 mg/（kg·d）］、中［5 mg/（kg·d）］、低［1 mg/（kg·d）］剂量干预组。实验前适应性饲养1周。

2 方法

2.1 动脉粥样硬化大鼠模型的建立

于实验第二周正常对照组喂食正常饲料，模型组、坎地沙坦各干预组均高脂饲料喂养并腹腔注射维生素D3建立动脉粥样硬化模型。（高脂饲料由基础饲料配方中添加2%胆固醇、10%猪油、0.5%胆酸钠、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶配制），正常对照组腹腔注射相同体积生理盐水。坎地沙坦各干预组分别按照高、中、低药物剂量进行灌胃，对照组、模型组均给予等体积生理盐水进行灌胃，共12周。

2.2 取材

于造模12周末，大鼠空腹12 h后，进行如下操作：（1）腹腔注射苯巴比妥进行麻醉。（2）大鼠仰卧位固定，去毛、消毒皮肤。沿正中线剪开、固定。（3）分离血管（主动脉弓至骼总动脉分叉处），剔除脂肪及结缔组织。（4）取主动脉弓，4 ℃生理盐水冲洗干净，在相同部位切取动脉环4个，放入4%戊二醛溶液进行前固定，冰箱4 ℃保存，待检。（5）主动脉弓下缘取主动脉1～2 cm， 10%中性甲醛固定，室温保存，待检。

2.3 检测项目及方法

固定好的腹主动脉，按步骤进行脱水、石蜡包埋，切片，HE染色、光学显微镜观察。用Imagepro plus6.0软件，每组选8张切片，测定血管内膜、中膜的厚度。电镜固定标本经0.1 M PBS清洗、1%饿酸固定、乙醇梯度逐级脱水、丙酮与树脂混合液浸透后放入盛有环氧树脂812、815混合包埋液的包埋板中置于烤箱中37 ℃、45 ℃、60 ℃各24 h。切片后，用柠檬酸铅和醋酸铀进行双重电子染色，设定80 kV的加速电压，透射电子显微镜下观察、拍照。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 光镜观察结果

正常组：血管壁各层结构清晰，内皮细胞结构完整，层次清楚光滑；内膜无增生，厚薄均匀；中膜弹力纤维同心圆状排列，平滑肌细胞呈梭形，无增生，排列整齐；外膜为疏松结缔组织，见图1。

模型组：血管壁内、中、外膜结构可见，但不清晰。内皮细胞阶段性损伤脱落，内皮下层宽度增加；内膜厚度增加明显，内膜下聚集大量泡沫细胞，见图2箭头所示；内弹力板断裂，凸起部位可见大量钙盐沉积，见图3箭头所示；有平滑肌细胞的迁移，且杂乱无章，向管腔突出；外膜无明显改变。

图1 正常组血管HE染色(×400)

图2 模型组血管HE染色(×600)

图3 模型组血管HE染色(×400)

坎地沙坦低剂量组：内皮细胞阶段性损伤脱落，内皮下层宽度增加；内膜增厚内膜下间隙增大；平滑肌细胞排列紊乱，并增生迁移入内膜，见图4箭头所示；坎地沙坦中、高剂量组：内皮细胞较少破损；内膜较光滑；中膜厚度正常；平滑肌细胞排列整齐，无增生迁移，见图5、图6。

图4 坎地沙坦低剂量组血管HE染色(×400)

图5 坎地沙坦中剂量组血管HE染色(×400)

图6 坎地沙坦高剂量组血管HE染色(×400)

3.2 电镜观察结果

正常组主动脉管壁结构清晰。内皮细胞呈梭形、扁平，表面平滑，细胞膜完整，内质网、线粒体结构清晰正常，无脂质沉积，相邻内皮细胞间细胞连接紧密，内弹力板平直，厚薄均匀、完整连续；平滑肌细胞核形态规则、细胞器结构正常，排列整齐，大小均匀，无内膜下迁移，见图7。

模型组内皮细胞坏死、溶解，大面积与基底膜脱离或脱落，内皮细胞细胞膜破损、缺失、不连续；细胞核碎裂溶解线粒体嵴溶解、断裂、消失；内弹性膜密度不均，薄厚不均，见图8；有些内皮细胞内可见较大圆形脂滴，见图9。平滑肌细胞核膜结构模糊；线粒体嵴溶解、断裂、消失；内质网明显扩张，有脱颗粒现象。

图7 正常组血管电镜表现（×4.0k）

图8 模型组血管电镜表现（×4.0k）

图9 模型组血管电镜表现（×12.0k）

坎地沙坦低剂量组内皮细胞坏死、溶解，部分或大面积与基底膜脱离或脱落，内弹性膜密度不均，薄厚不均；平滑肌细胞线粒体嵴溶解、断裂、消失；粗面内质网明显扩张，有脱颗粒现象，有颗粒融合；细胞内有圆形脂滴存在；排列紊乱，伸出伪足，向内皮下迁移，打乱内弹力膜，见图10所示。中剂量组内皮细胞吞饮小泡增加，可见线粒体嵴有一定损伤，粗面内质网有所扩张，内弹性膜薄厚均匀，见图11；平滑肌细胞排列整齐，无内膜下迁移。高剂量组内皮细胞吞饮小泡增加，内质网轻度扩张；内弹性膜薄厚均匀平滑肌细胞排列整齐，无内膜下迁移，见图12。

图10 坎地沙坦低剂量组血管电镜表现 （×9.0k）

图11 坎地沙坦中剂量组血管电镜表现 （×4.0k）

图12 坎地沙坦高剂量组血管电镜表现 （×8.0k）

3.3 坎地沙坦对血管内膜、中膜厚度的影响

模型组与正常组相比，内膜与中膜厚度显著增加（P＜0.01）；低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；坎地沙坦中、高剂量组较模型组内膜、中膜厚度均有显著减少（P＜0.01），而坎地沙坦高剂量组较中剂量组内膜增生减少明显（P＜0.05），见表1。

表1 坎地沙坦对动脉粥样硬化大鼠血管内膜、中膜厚度的影响（±s）

表1 坎地沙坦对动脉粥样硬化大鼠血管内膜、中膜厚度的影响（±s）

与正常组相比，aP＜0.01；与模型组相比，bP＜0.01；与坎地沙坦中剂量组相比，cP＜0.05。

4 讨论

目前由动脉粥样硬化导致的冠心病已经成为威胁中国人民身体健康的第一杀手。动脉粥样硬化是一种较为复杂的、缓慢进展的病理生理过程，会导致血管结构改变，功能障碍[2]，其最终会形成粥样硬化斑块。斑块形成会造成血管管腔狭窄，血流受到影响，造成靶器官供血不足，严重时斑块破裂，血栓形成，促发心脑血管事件。

本试验通过透射电镜观察到AS模型组血管结构出现明显异常改变。内皮细胞形态学的变化可使血管内膜的屏障作用减弱或者消失，同时内皮细胞脱落、内膜裸露可以引起血小板聚集及血栓形成[3]。由于血管内皮细胞受损，血管自身的保护屏障受到破坏，打破了各种生物活性物质之间的平衡，比如细胞生长因子。这种情况可以促进平滑肌细胞增殖和迁移，引起大量细胞外基质生成并沉积在内膜[4]，血管舒缩功能障碍，炎性细胞粘附于内膜促进动脉粥样硬化的进展。

坎地沙坦是一种具有高度选择性、组织亲和力强、解离慢、强效、长效的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）。肾素血管紧张素Ⅱ受体可分为AT1、AT2、AT3、AT4。心血管系统中主要存在AT1和AT2，现已知AngⅡ的大部分心血管效应由AT1介导。但越来越多的实验证实[5]: AT2 具有拮抗AT1的功能，AT1活性受拮抗时AT2活性增强。AT1受体激动时，引起血管收缩反应增强、外周血管组织升高、心输出量增多等效应。而AT2受体介导血管舒张，能激活缓激肽/NO/cGMP降压途径，与AT1受体引起的血管收缩效应相反。并且阻断AT2受体能增强AT1受体介导的PGE2作用，引起血管收缩[6]。AT2 受体可以发挥抗增殖、促血管平滑肌细胞分化、凋亡效应，并且能抑制血管的生长发育[7]。研究证实在AT2受体缺乏的情况下，小鼠左侧股动脉损伤后，与AT2受体正常相比，血管平滑肌的DNA合成增加、凋亡减少，并且新生内膜的合成也增加。坎地沙坦是AT1受体拮抗药，能减少AngⅡ，下调血管MMP-2、VEGF的表达，从而降低血管内膜通透性及血管重构[8]，并且能拮抗AngⅡ引起的肝脏血管收缩，增加肝脏内血流，保护肝脏功能[9]。本试验结果显示，坎地沙坦能减轻大鼠动脉粥样硬化的形态学改变。具体机制需进一步探索研究。

[1]刘娜,张煜.血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂坎地沙坦应用的研究进展[J].吉林医学,2008,29(5): 415.

[2]何翠瑶,李晓辉,李淑惠,等.三七皂苷对氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞保护作用的研究[J].中国药房,2008,19(6): 401-403.

[3]DAVIS B N,HILYARD A C,NGUYEN P H,et al.Induction of microRNA- 221 by platelet - derived growth factor signaling is critical formodulation of vascular smooth muscle phenotype[J].J Biol Chem,2009,284(6): 3728-3738.

[4]李薇,杜军保.动脉粥样硬化发病机制研究进展[J].实用儿科临床杂志,2009,24(1): 58-60.

[5]师树田,李艳芳.衰老大鼠心脏血管紧张素Ⅱ受体对α1肾上腺素受体信号转导的影响[J].中华老年心血管病杂志,2013,15(1):71-73.

[6]刘正生.血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗高血压的研究进展[J].临床合理用药,2012,5(5B): 168-169.

[7]黄书攀,陈坤赞.坎地沙坦酯治疗原发性高血压的疗效及对心血管重构的影响[J].全科医学临床与教育,2008,6(2): 112.

[8]周玉娟,刘莉,张喆,等.坎地沙坦对动脉粥样硬化大鼠血脂和血管 MMP-2、VEGF 表达的影响[J].江苏医药,2011,6(37): 636-639.

[9]朱淑芳,刘莉,周玉娟,等.坎地沙坦对动脉粥样硬化大鼠肝功能的影响[J].医学研究与教育,2010,2(27): 14-16.

（责任编辑：高艳华）

Candesartan on morphological change of artery in atherosclerosis rats

ZHOU Yujuan1,LIU Li1,LIU Chunying1,CAO Xiaohua2,CHEN Taoping2
(1.College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China; 2.Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Candesartan on morphological change of the artery in atherosclerosis model rats.MethodsNormal rats were fed with high lipid feedstuff to set up atherosclerosis rat model.Fifty rats were randomly divided into normal group,atherosclerosis model group,groups of low,medium and high dose of Candesartan.After 12 weeks,the arteries of the same place in rats of each group were determined and observed under light microscope and electron microscope.At the same time,we measured the intimal and medial thickness of vascular walls.ResultsCompared with normal group,morphological change of atherosclerosis in the arteries of model group had been observed.Compared with model group,morphological change of atherosclerosis which could be observed under microscope of the Candesartan group had decreased.In model group,compared with normal group,the intimal and medial thickness of vascular walls were signifcantly increased(P＜0.01).Compared with model group,the intimal and medial thickness were significantly reduced(P＜0.01).ConclusionCandesartan can infuence the morphology of artery in atherosclerosis rats and reduce the hyperplasia in the intima and media of vascular walls.

Candesartan; atherosclerosis; morphology

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.03.002

R54

A

1674-490X(2015)03-0006-05

2015-03-07

河北省教育厅项目（Z2011286）；保定市科学技术研究与发展计划项目（10ZF068）

周玉娟（1964—），女，河北深州人，教授，硕士，硕士生导师，主要从事心血管药理学研究。

E-mail: zyj@hbu.edu.cn

陈涛平（1976—），男，河北邯郸人，主治医师，硕士，主要从事临床骨科学研究。E-mail: CTP00@163.com