不同溶剂对多肽类抗原乳化效果的影响

娄永富，张雪娇，刘嘉琳，王荣爱，刘绍川，孟明

（河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

·基础研究·

不同溶剂对多肽类抗原乳化效果的影响

娄永富，张雪娇，刘嘉琳，王荣爱，刘绍川，孟明

（河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

目的探究多肽类抗原在与弗氏完全佐剂乳化过程中不同的抗原溶剂（无菌水和PBS缓冲溶液）对乳化效果的影响。方法利用三通管连接双注射器的人工乳化器推拉法进行抗原乳化，采用滴水实验检测乳化效果。结果以无菌水作为溶剂，乳化时间较长，乳化程度易于人工控制；以PBS缓冲液作为溶剂，会在极短时间即形成稳定的“油包水”乳剂，但容易乳化过度。结论多肽类抗原乳化过程中，不同抗原溶剂对乳化效果的影响有较大差异。

弗氏完全佐剂；多肽类抗原；抗原溶剂；乳化效果

本文引用：娄永富,张雪娇,刘嘉琳,等.不同溶剂对多肽类抗原乳化效果的影响[J].医学研究与教育,2015,32(3): 1-5.

佐剂（adjuvant）是指预先或与抗原同时注入体内，能够增强机体对该抗原免疫应答的非特异性免疫增强性物质[1]。目前最常用于动物实验的佐剂是弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA）和弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）。在进行人工免疫诱导实验中，常将佐剂与抗原溶液按比例混合进行乳化，以增强抗原诱导机体发生的免疫反应，获得高效价抗体。CFA是Freund[2]发明的主要由矿物油、羊毛脂和卡介苗等组成的佐剂，常用于小分子可溶性抗原的乳化：通过延长抗原在动物体内潴留时间，刺激抗原提呈细胞，增强其对抗原的加工和提呈以及刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答效应（即产生体液免疫和细胞免疫应答）[3]。

本课题组在进行类风湿关节炎（RA）的动物实验研究[4]过程中，选用葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）多肽[5]片段为抗原诱导DBA/1小鼠制备RA模型[6-7]。为了保持多肽抗原的稳定性、增强抗原的免疫原性，在免疫动物前，需要先将水溶性抗原GPI多肽与CFA混合进行乳化[8]，以形成稳定的“油包水”乳剂[9]。

在乳化过程中发现，水溶性的GPI多肽抗原以无菌水溶液为介质和以PBS缓冲液为介质进行抗原乳化的效果存在明显差异。本实验旨在观察和比较不同的抗原溶剂对GPI多肽与CFA乳化效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

弗氏完全佐剂：10 mL，F5881,购自美国SIGMA公司。预冷去离子水（pH=7.0）。预冷PBS缓冲液：浓度为0.01 mol/L，pH=7.2，购自Invitrogen (Grand Island,NY,USA)。GPI多肽（325-339和469-483两个肽段）4 mg，合成于北京赛百盛公司。三通管 2 个、10 mL塑料注射器 4 个、1000 µL及200 µL移液器各1只、烧杯若干、冰水混合物等。

1.2 方法

1.2.1 乳化方法

采用三通管连接双注射器的人工乳化器推注法[10（图1）。实验分为两组，同时进行以方便比较。

无菌条件下操作，预先将CFA经50℃加热融化（液态油，浅黄色），备用。两个实验组分别采用无菌去离子水或无菌PBS缓冲液4 mL溶解GPI多肽2 mg，制备抗原液；再将CFA与每一种抗原液按照1∶1比例，分别吸入1套人工乳化器的注射器内（2个注射器以三通管相连，接口处要连紧）。之后每组两个操作者面对面推拉针芯，使溶液通过三通管进入对侧注射器针管内，每次推动针芯时必须把针管的内容物全部推空，另一侧也同样操作，使液体在针管内往返混合。乳化操作应保持匀速进行，最佳推拉频率为10～15 次/分。

1.2.2 检测方法

滴水试验[11]:准备冰水混合物置于烧杯中，用移液器从人工乳化器中吸取适量待检样品，滴数滴于冰水表面，观察油滴在水面散开的时间（需静置观察10 min以上）。

2 结果

油滴在10 min不散开者提示样品已完全乳化，形成了稳定的油包水状态（图2）。两个实验组均以时间为梯度，连续观察和检测不同时间段的乳化效果，并对结果进行分析。

两种不同抗原溶剂的乳化效果显示，以预冷的去离子水为溶剂，抗原完全乳化是个渐进的过程（图3、图4），所需时间较长（至少25 min），乳化的程度可以人工把握，不易出现过度乳化。但由于乳化过程较长，需要在低温条件下操作，方可避免抗原变性。因此，抗原乳化推注过程尽可能在冰浴条件下进行。与无菌水相比，预冷的PBS缓冲液作为抗原溶剂能够迅速改变CFA的物理状态（如颜色、黏稠度等），用乳化器推拉针芯2～5 min即形成油包水的乳化状态抗原（GPI和CFA），继续推拉则CFA很快变成乳白色稠奶油状（图5），操作者难以把握完全乳化的最佳时间段和推拉次数，极容易乳化过度（图6）。

表1 样品乳化过程中的物理状态变化

表2 样品乳化过程中的滴水试验检测

图1 三通管机械乳化法

图2 乳化完全，稳定的“油包水”状

图3 去离子水乳化2 min

图4 去离子水乳化20 min

图5 PBS缓冲液乳化15 min

图6 PBS缓冲液乳化20 min

3 讨论

佐剂的作用机制主要为：（1）改变抗原物理性状，延缓抗原降解，延长抗原在体内潴留时间。（2）刺激抗原提呈细胞，增强其对抗原的加工和提呈。（3）刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答效应[12]。本实验中使用的CFA作为佐剂的一种，其中，石蜡油因不能被机体代谢而使乳剂潴留在注射的部位，大大阻碍了抗原降解速度，使抗原能够缓慢地释放，持续刺激机体产生免疫反应；羊毛脂对水溶性抗原与油形成稳定的乳剂具有重要促进作用；灭活的结核分枝杆菌可以非特异性的激活免疫系统（包括体液和细胞免疫应答）[13-15]。

作为疫苗制备的关键环节，抗原乳化是将佐剂与抗原溶液按比例混合，制备成 “油包水”乳剂的过程[16]，其作用机制是在有油和水的混合物中加入乳化剂（本实验为羊毛脂）后，进行机械混合，一方面，乳化剂的亲水基结合水，亲油基结合油，使油-水两相之间形成一层致密的介面膜，降低了油与水之间的接口张力形成小液滴，同时对液滴起保护作用；另一方面，由于乳化过程中吸附和摩擦等作用使得液滴表面带电，带电液滴在接口的两侧会形成双电层结构，其排斥作用使得小液滴难以聚集，从而提高了乳化液的稳定性[17-18]。理想的乳化能增强机体的免疫应答，提高免疫抗原的保护效果[19]。因此，乳化过程十分重要，而佐剂、抗原溶剂、时间、温度、乳化器及操作技巧等每个环节的变化，都会影响乳化效果。

目前已有报道[20]，去离子水和PBS缓冲液都可以作为抗原乳化的溶剂，且在乳化过程中不改变抗原的结构和免疫原性。本实验结果显示，以去离子水为溶剂进行GPI多肽抗原和CFA乳化，是一个缓慢而温和的过程，乳化时间相对较长，便于人工控制，但冰浴乳化操作较繁琐。以PBS缓冲液为溶剂进行乳化，则是一个快速的过程，乳化完成时间较短（2～5 min），容易乳化过度，难以人工控制。这可能是由于PBS缓冲液中的磷酸根基团[21-24]之间的静电斥力作用，增强了乳化液的稳定性[25],从而加速了完全乳化的过程。如果继续乳化（时间较短），PBS缓冲液中Na+、K+离子与磷酸根基团充分接触，压缩双电层，使其厚度变薄，乳状液的稳定遭到破坏，小液滴聚集，乳剂粘度增加，导致乳化过度[26]。实验结果提示，若在可控制乳化程度的前提下加快乳化速度，可以尝试用无菌水为主要溶剂，添加少量或低浓度的PBS 缓冲液作为辅助溶剂。至于无菌水与添加PBS缓冲液的比例和条件，还需要进一步试验进行摸索。

此外，乳化器的材质和乳化过程的温度也很重要。如果选用一次性塑料注射器，因其封闭良好、不易漏液更适用于少量的或昂贵的抗原乳化，但其摩擦阻力较大，乳化时间越长越难推动；有时还可能因为样品量大，乳化时间长出现掉色现象，使溶液变黑，影响实验效果。玻璃注射器克服了塑料的材质问题，且磨砂针芯有利于抗原乳化，但不足是玻璃注射器易漏，容易造成抗原的浪费。此外，低温条件虽然使乳化速度变慢，却能防止抗原变性，所以用注射器推拉乳化抗原的操作要在冰浴条件下进行。

综上所述，抗原乳化过程中，需要综合考虑抗原溶剂、乳化程度的可控性、乳化器材质、环境温度等综合因素，方能得到最佳的乳化效果：既保持抗原的稳定性，又延长抗原在动物体内的时间，提高免疫原性，成功造模。

[1]刘洋,曹雪涛.免疫佐剂研发和临床转化的现状与发展趋势[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2014,21(2): 192-202.

[2]FREUND J.The mode of action of immunologica1 adjuvants[J].Adv Tuberc Res,1956,7 (10): 130-148.

[3]霍华德 G C,凯瑟 M R.抗体制备与使用实验指南[M].张权庚,张玉详,译.北京: 科学出版社,2010: 20-25.

[4]孟明,周蕾,高伟敏,等.活化血小板对类风湿关节炎滑膜炎症和增生影响的实验研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(8): 828-833.

[5]王黎醒,李小峰,赵向聪,等.血清葡萄糖-6-磷酸异构酶与类风湿关节炎的相关性研究[J].中国医药指南,2013,11(16): 631-633.

[6]IWANAMI K,MATSUMOTO I,TANAKA-WATANABE Y,et al.Crucial role of the interleukin-6/interleukin-17 cytokine axis in the induction of arthritis by glucose-6-phosphate isomerase[J].Arthritis Rheum,2008,58(3): 754-763．

[7]MATSUMOTO I,ZHANG H,YASUKOCHI T,et al.Therapeutic effects of antibodies to tumor necrosis factor-alpha,interleukin-6 and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 immunoglobulin in mice with glucose-6-phosphate isomerase induced arthritis[J].Arthritis Res Ther,2008,10(3): R66.

[8]IWANAMI K,MATSUMOTO I,TANAKA Y,et al.Arthritogenic T cell epitope in glucose-6-phosphate isomerase-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther,2008,10(6): R130．

[9]FERNANDEZ P,PETRES S,MECHERI S,et al.Strain-transcendent immune to recombinant Var2CSA DBL5-domain block P.falciparum adhesion to placenta-derived BeWo cells under flow conditions [J].PLoS One,2010,5(9): e12558.

[10]黄小荣,梁昌盛,骆晓枫,等.抗原-弗氏佐剂乳化实验技术的改进与技巧[J].实验室研究与探索,2013,32(8): 265-285.

[11]罗波,毛樱逾,段素群,等.弗氏佐剂与抗原乳化方法的改良及其应用[J].现代预防医学,2012,39(5): 1200-1206.

[12]徐凤宇,何昭阳.免疫佐剂的作用机制及其应用[J].中国兽医科学,2007,37(5): 449-455.

[13]周莉婷,赵晶晶,吴彦卓,等.分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展[J].药物生物技术,2011,18(2): 176-179.

[14]李瑶瑶,明恒强.我国免疫佐剂的研究现状[J].兽药与饲料添加剂,2009,14(5): 11-14.

[15]李学钊,洪场,王治仓,等.免疫佐剂研究进展及前景展望[J].中国动物传染病学报,2014,22(4): 81-86.

[16]DONAYRE-TORRES A J,ESQUIVEL-SOTO E,GUTIE RREZ-XICOTE NCATL MDE L,et al.Production and purification of immunologically active core protein p24 from HIV-1 fused to ricin toxin B subunit in E.coli[J].Virol J,2009,6: 17.

[17]韩霞,程新皓,王江,等.阴阳离子表面活性剂体系超低油水界面张力的应用[J].物理化学学报,2012,28(1): 146-153.

[18]谭文英,许勇,王述洋,等.乳化剂及助乳化剂提高生物油/柴油乳化性能[J].农业工程学报,2013,29(24): 235-242.

[19]LOUDON PT,YAQER EJ,LYNCH DT,et al.GM-C SF increases mucosal and systemic immunogenicity of an H1N1 influenza DNA vaccine administered into the epideim is of non-human primates [J].PLoS One,2010,5(6): e11021.

[20]牛凤云,陈会娟,贾维刚,等.肌力康饮对EAMG大鼠血清AchR-Ab及TGF-B1水平的影响[J].中华中医药学刊,2010,28(1): 80-82.

[21]钱毅玲,赵谋明,赵强忠.卡拉胶/黄原胶和K+浓度对低脂低盐乳化肠凝胶品质影响的研究[J].现代食品科技,2009,25(7): 734-737.

[22]徐小刚,杜鹃,罗艳,等.乙烯基聚硅氧烷低聚物乳液的制备及应用[J].印染助剂,2013,30 (6): 18-22.

[23]宋儒坤,李斌,许沙沙,等.卵黄高磷蛋白的功能与应用研究[J].中国家禽,2011,33(16): 40-42.

[24]郑配国,马雪涵,张俊华,等.CDllb 在小鼠脾脏和淋巴结细胞中的差异表达及其功能[J].细胞与分子兔疫学杂志,2014,30(12): 1271-1273.

[25]马杰,张士璀.卵黄蛋白的结构和功能[J].鲁东大学学报: 自然科学版,2012,28(3): 252-260.

[26]张付轩,张战修.影响乳化的因素[J].中国中医药现代远程教育,2011,9(3): 185-186.

（责任编辑：刘俊华）

Effects of different solvents on the polypeptide antigen’s emulsifcation

LOU Yongfu,ZHANG Xuejiao,LIU Jialin,WANG Rongai,LIU Shaochuan,MENG Ming
(College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China)

ObjectiveTo study the effects of different solvents (sterile water and PBS buffer) on the polypeptide antigen’s emulsification.MethodsDissolved polypeptide antigen was completely emulsified with complete Freund’s adjuvant by the way of pull-and-push with an artificial blender connecting three-way pipe and two syringes.The effects of emulsified mixture were evaluated by water drip test.ResultsThe emulsification time was longer and the procedure was easy to control by taking the sterile water as solvent.The stable water in oil emulsifier was formed in a short time by taking the PBS buffer as solvent,whereas it was easy to get over emulsifed.ConclusionThe effects of different solvents on the polypeptide antigen’s emulsifcation were different signifcantly.

complete Freund's adjuvant; polypeptide antigen; antigen solvent; emulsion affection

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.03.001

R392

A

1674-490X(2015)03-0001-05

2015-04-27

国家自然科学基金（81373197）；河北省自然科学基金（H2014201133）；河北大学医学学科建设基金（2014A1001、2014A1002）；国家级大学生科技创新项目（2014099）

娄永富（1992—），男，满族，河北承德人。

孟明（1964—），女，辽宁义县人，教授，博士，硕士生导师，主要从事自身免疫病及免疫药理学研究。

E-mail: mengming127@163.com