医疗器械细胞毒性试验方法标准化探讨

贺学英，王 蕊，王会如

(北京市医疗器械检验所，北京101111)

医疗器械细胞毒性试验方法标准化探讨

贺学英，王 蕊，王会如

(北京市医疗器械检验所，北京101111)

细胞毒性是医疗器械生物相容性评价的重要项目之一。四唑盐MTT法是经典定量细胞毒性试验方法，该实验研究了细胞浓度、培养时间对试验结果的影响。结果表明应用不同试验条件的MTT法对同一待检物会得到不同的细胞毒性结果，因此标准化MTT试验方法对医疗器械细胞毒性试验评价非常重要。

MTT法细胞毒性试验;细胞生长曲线;L929细胞系

0 前言

细胞毒性是医疗器械生物相容性评价的重要项目之一。GB/T16886.5－2005《医疗器械生物学评价—体外细胞毒性试验(ISO 10993.5:1999，IDT)》中给出了浸提液法、直接接触法、滤膜扩散法等方法的原则，并简要介绍了细胞毒性可定性或定量评价，但该标准并未给出各方法的标准操作程序(SOP)。MTT法是一种经典的定量细胞毒性试验方法，GB/T14233.2－2005给出了该方法的SOP，目前国内广泛采用这一方法对医疗器械进行细胞毒性评价。我国尚未转化的ISO10993－5:2009(以下称2009版国际标准)较1999年版本发生了较大变化，新版标准具体化了细胞毒性试验方法，在附录c中详细给出了MTT法细胞毒性试验的SOP，该SOP与GB/T14233.2－2005给出方法有较大不同。不同的MTT试验方法对同一待检物会是否能得出一致的结果是本研究要解决的问题，这关系到能否对待检物做出客观科学的评价。

1 材料与方法

(1)L929细胞系(ATCC)，MEM细胞培养基，3－(4，5－二甲基噻唑－2) －2，5－二苯基四氮唑溴盐(简称MTT)。

(2)取100μL浓度为1×104/mL，1.5×104/mL，2× 104/mL，5×104/mL，8×104/mL，1×105/mL，2×105/mL的L929细胞分别接种于96微孔板中，相当于每孔分别接种细胞数约1×103，1.5×103，2×103，5×103，8×103，1×104，2×104，培养4 h～120 h，每24 h以MTT掺入的方式监测细胞增殖情况并绘制生长曲线。

(3)同一被检物分别应用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009给出的MTT试验方法检测其细胞毒性。

2 结果与讨论

2.1 不同起始细胞密度L929细胞生长曲线测定

当接种浓度较低为1×104/mL，1.5×104/mL，2×104/mL时，L929细胞在72 h之前都处于增殖缓慢状态;在8× 104/mL，1×105/mL两个个浓度下，细胞在生长24 h后进入对数生长期，并在72～96 h进入平台期;2×105/mL浓度组细胞贴壁后即进入对数生长期，48 h起即进入平台期。如表1，不同起始接种浓度L929细胞随培养时间生长增殖情况，以酶标仪570nm与630nm测定吸光度差值表示;图1直观显示了细胞生长曲线。

表1 不同接种密度L929细胞增殖情况

细胞生长进入对数生长期之前，对生长环境的变化反应较敏感，因此为排除细胞本身生长带来的干扰，细胞毒性试验应选择处于对数生长期阶段给予刺激物，以真实反应待检物对细胞生长的抑制程度，这一点在2009版国际标准中特别进行了强调。

2.2 同一被检物细胞毒性试验

选取一高分子材料分别应用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009给出的MTT试验方法检测其细胞毒性，结果如下:

(1)GB/T 14233.2－2005中8.5.6 a)方法:L929初始接种浓度为1×104/mL，生长24 h后加入待检物浸提液，培养72 h，细胞相对增殖率为15.9%，可判为有毒性。

图1 L929细胞在不同起始密度生长曲线

(2)ISO 10993－5:2009附录c方法:L929初始接种浓度为1×105/mL，生长24 h后加入待检物浸提液，培养24 h，细胞相对增殖率为94.3%，可判为无毒性。

同一待检物以不同MTT试验方法得到完全不同的细胞毒性结果，对需做出依据试验结果做出合格判断的机构来说会带来很大困惑。

从图1生长曲线可以看出GB/T 14233.2－2005方法要求接种细胞的初始浓度较小，细胞在生长24 h后还未进入对数生长期，对任何因素的变化都会有较敏感的反应，可能会放大待检物微小的细胞抑制作用;而在ISO 10993－5: 2009方法中，细胞初始接种量是GB/T 14233.2－2005的10倍，24 h后细胞已进入对数生长期，可较客观地反应待检物对细胞生长的影响。

根据细胞生长曲线，还有一个需要特别注意的问题:“加入待检物后，细胞还应培养多久?是不是越久越能反应出待检物的毒性?”

2009版国际标准规定:在待检物作用24 h后细胞读取结果，这时候对照组细胞仍应处于对数生长期，实验组与处于对数生长期的对照组相比较得到其真实增殖率;如果待检物加入后培养48 h或更长时间，从图1可以看到，这时候对照组已开始进入平台期，进入平台期后细胞的增殖会受到抑制并开始凋亡，而当待检物对细胞只有抑制作用而非杀伤作用时，实验组细胞生长达到平台期的时间会延后，经过较长时间的培养后，实验组细胞的增殖程度可能反而会赶上或超过对照组，当计算相对增殖率时会得到假阴性结果，也就是说有时延长培养时间反而不能反映出待检物的细胞毒性。

综上，MTT试验的标准操作规程(SOP)需明确规定合理的细胞初始接种量及待检物加入后的培养时间，不能在SOP中出现弹性的要求，如“加入待检物后培养时间不小于24 h”，或“培养24～72 h”;当细胞相对增殖率超过100%时，要特别密切关注试验的原始吸光值，分析结果是否合理;如应用编好的程序直接读取细胞相对增殖率，不记录原始吸光值度，则会产生较大风险。

3 结论

应依据所应用细胞系生长特性，选择MTT法细胞毒性试验条件，并应标准化，随意改变试验条件会得到不同的试验结果，不利于对医疗器械细胞毒性进行客观、科学的评价。

［1］GB/T 14233.2－2005医用输血、输液、注射器具检验方 第2部分:生物学试验方法［S］.

［2］ISO10993－5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity［S］.

R197.39

A

1002－2376(2015)07－0009－02

2015－05－04