RP-HPLC法测定川楝子提取物中川楝素的含量

杨 欢，赵学伟，胡 楠

（1.承德医学院中药学系2012级本科，河北承德 067000;2.指导教师）

（学生园地栏目编辑:张 健）

川楝子，别称金铃子，为楝科植物川楝(Melia toosendan Sied.Et Zucc)的果实。川楝子以“楝实”之名始载于《神农本草经》。川楝子性苦寒，有小毒，具有舒肝、行气止痛、驱虫等作用，用于胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛等病症的临床治疗[1]。川楝素(Toosendanin,C30H38O11)为川楝子中已明确的化学成分，也是起到药理作用的主要成分，是一种四环三萜化合物[2]。本研究采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC）测定川楝子药材提取物中川楝素的含量，方法简便、快速、稳定性好，为川楝素的定量分析提供了参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 1515-717i-2487液相系统，美国Waters公司;Empower 2数据处理系统，美国Waters公司;BP211D(Max 210g,d=0.01mg)电子分析天平，德国Sartorius公司;KQ-100型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂 甲醇(HPLC级)，美国Fisher公司;乙腈(HPLC级)，美国Fisher公司;川楝子，购自亳州医药公司(经中国中医科学院中药研究所何希荣老师鉴定为正品）;川楝素对照品(批号130621），成都普菲德生物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 川楝子提取物的制备 取川楝子药材，粉碎，加入8倍量60%的乙醇，加热回流提取2h，共提取3次。提取液趁热过180目筛，减压回收乙醇，真空干燥，干燥物粉碎成细粉，过80项目筛，得到川楝子提取物。

2.2 供试品溶液的制备 称取2.1项中得到的川楝子提取物0.25g，置三角烧瓶中，加入10ml甲醇，称重，超声提取1h。室温放冷，再称重，甲醇补重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜过滤后备用。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取川楝素对照品95mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为95μg/ml的川楝素对照品溶液，备用。

2.4 色谱条件 Ultra ll C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相:乙腈:水(35:65);流速：1.0ml/min;检测波:215nm;柱温:30℃。上述色谱条件下得到对照品和提取物的色谱图见附图:

附图 川楝素对照品(A)和提取物(B）色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察:精密吸取浓度为95μg/ml的对照品溶液2,4,6,8,10,15μl,注入液相色谱仪，按照2.4项的色谱条件进行分析。以进样量(X)对色谱峰面积(Y)进行线性回归处理，得回归方程:Y=309.87X+9.5109,r=0.9993。结果表明，川楝素在0.192-1.44μg范围内呈良好线性关系。

2.5.2 精密度试验:精密称取川楝子提取物粉末0.25g，按2.2项的方法制备供试品溶液，按照2.4项的色谱条件重复进样5次，得到川楝素色谱峰面积，RSD为1.1%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验:精密称取川楝子提取物粉末0.25g，共5份，按2.2项的方法制备供试品溶液，分别取5μl注入液相色谱仪，按照2.4项的色谱条件进行分析测定，得到川楝素色谱峰面积，RSD为2.3%(n=5)，表明本方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验:精密称取已知川楝素含量的川楝子提取物粉末适量，共5份，分别精密加入一定量的川楝素对照品，按2.2的方法制备供试品溶液，测定并计算加样回收率。平均加样回收率为99.1%，RSD为1.5%（n=5），表明本方法准确度良好。结果见附表。

2.5.5 稳定性试验:精密称取川楝子提取物粉末0.25g，按2.2项的方法制备供试品溶液，按照2.4项的色谱条件，分别在0、4、8、12、24h 进样5μl，得到川楝素色谱峰面积的RSD为2.1%(n=5)。结果表明，川楝素在24h内稳定性良好。

附表 加样回收率试验结果

2.5.6 样品含量测定:按2.2项的方法制备川楝子提取物供试样品溶液3份，按照2.4项的色谱条件进样10μl测定，根据标准曲线方程计算川楝素的含量，样品1、2、3中川楝素的含量分别为3.55mg/g、3.44mg/g和3.34mg/g。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取川楝素对照品，进行紫外全波长扫描，得到川楝素最大吸收波长为208.2nm，但在此波长处存在末端吸收。为了消除背景，提高信噪比，得到良好峰形，本实验对不同波长处的色谱峰进行比较，最终确立川楝素的检测波长为215nm。

3.2 提取工艺 川楝子药材中川楝素含量很低，为保证药材中川楝素含量测定的准确性，在之前的实验中，采用L9(34)正交设计表，考察了乙醇浓度、回流时间及提取次数对川楝素提取率的影响，最终确立了2.1项中川楝子提取物的制备方法。

3.3 含量测定 在2010版中华人民共和国药典中依然未给出川楝素含量测定的方法。现存文献中，川楝素的含量测定包括薄层色谱法[3]、HPLC法[4]、液质联用法(LCMS)[5]等。本实验建立了RP-HPLC法测定川楝子提取物中川楝素含量的方法，可以较好地将川楝素的色谱峰与杂质峰分离，能反映样品的真实性，方法简便、准确、灵敏，为川楝素的定量分析提供了参考。在含量计算的过程中，由于川楝素化学结构中存在醛-酮式结构的互变，表现在色谱图中为双峰，因此将峰面积带入2.5.1项中得到的线性方程进行含量计算时，川楝素色谱峰峰面积为得到的川楝素两个同分异构体色谱峰峰面积之和。

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典一部(2010年版)[M].北京:中国医药科技出版社，2010.39.

[2] 舒国庆，梁晓天.关于川楝素化学结构的修正[J].化学学报，1980，38(2):196-198.

[3] 吴安安，张弦，潘扬.苦楝皮苦楝果中苦楝素含量的薄层-比色法测定研究[J].中医药学刊，2003,21(1):159-160.

[4] 王旭，杨建云，肖炳坤，等.RP-HPLC法测定川楝子水提醇沉提取物中川楝素的含量[J].科学技术与工程，2013,13(16):4631-4634.

[5] Ong ES,Ong CN.Qualitative and quantitative analysis of toosendan in Melia toosendan Sieb.Et Zucc (Meliaceae) with liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2007,21(4):589-598.