不同煎煮时间大黄水提取液对幼年大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响

杨 宵，张树峰，万慧杰，赵盼盼，佟继铭

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

(基础医学栏目编辑:陈志宏)

大黄为常用中药，主要活性成分是蒽醌类化合物，有泻下攻积、利湿退黄等多种功效[1-2]。大黄临床应用广泛，能用于减脂减肥、排毒养颜，但国内外有报道称长期服用大黄对肝脏、肾脏以及生殖系统均可造成不同程度的毒性[3]。本研究通过观察幼年雌性大鼠子宫凋亡相关因子Bax和Bcl-2的表达情况，探讨长期使用大黄对子宫细胞凋亡的影响及与煎煮时间的关系，以期为大黄的临床安全用药提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:雌性4周龄SD大鼠，体重60-70g，许可证号:SCXK(京)2009-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 药材与试剂:大黄(批号:20090902），安国市长安中药材有限公司;兔抗Bcl-2多克隆抗体(批号:YE1116W)、兔抗Bax多克隆抗体(批号:990197W），北京博奥森生物科技有限公司;免疫组化试剂盒(批号:20120813），北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 大黄水煎剂的制备 大黄药材粉碎后，10倍水浸泡2h，煎煮两次，每次煎煮10min/30min，合并煎煮液、过滤，40℃减压浓缩至含生药量0.4g/ml备用。

1.3 大鼠分组及给药 70只雌性4周龄SD大鼠随机分组，每组10只:空白对照(NC)组，水煎(RDA）10min 3个剂量组(0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg）和RDA 30min 3 个 剂 量组(0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg）。RDA各组大鼠连续灌胃给予相应剂量不同煎煮时间的大黄30d，NC组大鼠灌胃给予等体积的蒸馏水。

1.4 大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的检测 大鼠末次给药后禁食不禁水，24h后麻醉处死，取子宫，10%甲醛固定后常规石蜡包埋，5μm厚连续切片。采用SP免疫组化法检测大鼠子宫Bcl-2和Bax的表达情况，一抗1:100稀释，用PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素复染细胞核。采用IPP 6.0软件测定子宫组织Bcl-2和Bax表达免疫组化染色的OD值，计算各组OD值的平均值并进行半定量分析。

1.5 统计分析 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同煎煮时间大黄水提取液对大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响 RDA 10min 0.5、1.0、2.0g/kg 剂量组和RDA 30min 2.0g/kg剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白的表达水平显著低于NC组，Bax蛋白的表达水平明显高于NC组(P＜0.05）。见附表:

附表 大鼠子宫Bcl-2和Bax的表达情况（±s，n=10）

附表 大鼠子宫Bcl-2和Bax的表达情况（±s，n=10）

与NC组比较:aP＜0.05;与相同煎煮时间0.5g/kg剂量组比较:bP＜0.05；与RAD 30min 0.5g/kg剂量组比较:cP＜0.05，与RAD 30min 1.0g/kg剂量组比较:dP＜0.05，与RAD 30min 2.0g/kg剂量组比较:eP＜0.05

组别 Bcl-2(OD值） Bax(OD值）NC 组 0.331±0.041 0.126±0.042 RAD 10min 0.5g/kg 0.231±0.033ac 0.207±0.044ac 1.0g/kg 0.187±0.043abd 0.297±0.042abd 2.0g/kg 0.159±0.052abe 0.341±0.039abe 0.5g/kg 0.309±0.043 0.147±0.033 1.0g/kg 0.281±0.053 0.166±0.036 2.0g/kg 0.219±0.035ab 0.233±0.051ab RAD 30min

2.2 相同煎煮时间不同剂量大黄水提取液对大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响 大黄煎煮10min，1.0g/kg、2.0g/kg组大鼠子宫Bcl-2的表达明显低于0.5g/kg组、Bax的表达明显高于0.5g/kg组(P＜0.05）。大黄煎煮30min，2.0g/kg组大鼠子宫Bcl-2的表达明显低于0.5g/kg组、Bax的表达明显高于0.5g/kg组(P＜0.05）。见附表。

2.3 不同煎煮时间相同剂量大黄水提取液对大鼠子宫Bcl-2和Bax表达的影响 大黄煎煮10min 3个剂量组大鼠子宫Bcl-2的表达均低于大黄煎煮30min相同剂量组，Bax的表达明显高于大黄煎煮30min相同剂量组(P＜0.05）。见附表。

3 讨论

凋亡相关蛋白的表达水平对维持细胞内环境的平衡起着关键作用，决定细胞的状态[4-5]。Bcl-2和Bax是最具代表性的一对凋亡相关蛋白，Bcl-2可抑制细胞凋亡，Bax是其同源基因，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用从而影响细胞生存，二者的比值决定了细胞的“命运”[6-7]。当Bcl-2和Bax的比值过高或过低时，细胞将发生异常增生或者凋亡[8-10]。

本研究采用免疫组化法观察了大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白的表达水平，结果显示，不同煎煮时间和不同剂量大黄水提取液对雌性幼年大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达有不同程度的影响。水煎10min各剂量组对大鼠子宫Bcl-2和Bax表达均有明显影响，Bcl-2蛋白表达显著降低、Bax蛋白表达显著升高，其中水煎10min 2.0g/kg剂量组大鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达的变化最为明显。而煎煮30min只有2.0g/kg剂量组对幼鼠子宫Bcl-2和Bax蛋白表达有明显影响;并且，水煎30min各剂量组大鼠子宫Bcl-2蛋白的表达明显高于、Bax蛋白表达明显低于水煎10min各剂量组。本研究提示，煎煮10min大黄水提取液可明显促进雌性幼年大鼠子宫细胞的凋亡;而随着煎煮时间的延长，大黄水提取液对子宫的促凋亡作用减弱，但具体机制有待于深入研究探讨。

综上所述，大黄水提取液可促进雌性幼年大鼠子宫细胞凋亡，影响程度与煎煮时间以及给药剂量有关，其中水煎30min大黄水提取液对雌性幼年大鼠子宫的促凋亡作用较水煎10min明显减弱。

[1] 卢宁，张树峰，佟继铭，等.大黄水提物对成年雌性大鼠子宫中Bcl-2、Bax表达的影响[J].时珍国医国药，2014，25(7):1605-1606.

[2] 卢宁，张树峰，佟继铭，等.大黄水提物对成年大鼠子宫及卵巢的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，1（921):258-261.

[3] 王清秀，吴纯启，廖明阳，等.大黄及其主要成分的毒性毒理研究[J].毒理学杂志，2007，2（14）：301-302.

[4] 韩萍，王婧瑶.卡铂对雌性大鼠卵巢及子宫毒性的实验[J].毒理学杂志，2009，2（33):208-212.

[5] 王雷，刘明.苦参碱对大肠癌细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响[J].中国肿瘤，2012，2（13):237-240.

[6] 刘淑敏，常薇.邻苯二甲酸酯致雌性生殖系统毒性及其机制的研究进展[J].环境与健康杂志，2013，3（04）：374-377.

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[8] 黄韧.中药生川乌对小鼠卵巢和子宫发育的影响试验研究[J].临床和实验医学杂志，2009，（810）：3-4.

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