T细胞斑点试验在结核性胸膜炎的诊断价值

申 洁，柴 青(延安市人民医院呼吸内科，延安 76000;西安医学院第一附属医院全科;通讯作者，E-mail:4708985@qq．com)

结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO估计，全球有约20亿人感染结核分支杆菌，每年有约200万人死于结核［1］。中国是22个结核病高负担国家之一［2］。结核性胸膜炎是胸腔积液的常见原因，在我国胸腔积液住院患者中结核性胸腔积液占到 49．5%-54．5%［3］。目前结核性胸膜炎诊断缺乏特异性手段，实际临床工作中，以临床综合诊断为主。T细胞斑点试验(T cell enzyme-linked immunospot，T-SPOT．TB)由酶联免疫斑点(enzymelinked immunospot assay，ELISPOT)技术发展而来，结核菌感染后体内长期存在特异性T细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，释放γ-干扰素。早期分泌靶抗原6(early secreted antigenic target 6，ESAT-6)和培养滤过蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)是结核分支杆菌的特异靶抗原，ELISPOT通过联合使用结核菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10，降低与BCG疫苗和多种环境分支杆菌的交叉反应，从而提高释放γ-干扰素的特异效应性T细胞的检出率［4］。本研究主要是对临床确诊结核性胸膜炎与非结核性胸膜炎患者T-SPOT．TB结果进行研究分析，评价该方法对结核性胸膜炎的诊断价值。

1 资料与方法

1．1 研究对象

收集2013-01～2014-06延安市人民医院和西安医学院第一附属医院呼吸内科、胸外科、肿瘤科、传染科住院311例按Light标准诊断为渗出性胸膜炎患者。

按照胸腔积液是否为结核性胸腔积液将311例患者分为:①结核性胸腔积液组(实验组):均为实验室细菌学或组织学确诊病例或临床诊断结核性胸腔积液经诊断性抗结核治疗随访2月治疗有效者。②非结核性胸腔积液组(对照组):组织病理学确诊恶性胸腔积液者，临床诊断肺炎旁积液或脓胸抗感染治疗胸水吸收者，确诊风湿性疾病引起的胸腔积液者，排除结核合并肿瘤者，排除结核合并脓胸者。

结核性胸腔积液组共182例，其中男性125例，女性57例，平均年龄(42．8±19．3)岁。非结核性胸腔积液组共129例，其中男性85例，女性44例，平均年龄(58．8 ±16．3)岁。

1．2 仪器与试剂

生物安全柜(青岛海尔生物公司)，CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司)，T-SPOT．TB试剂盒(牛津Immunotec公司，英国)和BD单个核细胞分离器。

1．3 方法

1．3．1 T-SPOT．TB检测方法 肝素抗凝管采集静脉血4 ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。样本采集后尽快进行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离，用细胞培养基AIM-V重悬细胞，并将浓度调整至2．5×106/ml。从铝封袋中拿出96孔的培养板(使用抗γ-IFN单抗包被)，在阴性对照孔中标记且按一定顺序加入50 μl AIM-V，在 A 孔中加入 50 μl ESAT-6(抗原A)，在 B孔中加入50 μl CFP-10(抗原 B)，使得两种抗原的最终浓度为10 μg/ml，再将阳性对照孔中加入50 μl植物血凝素;将已制备细胞稀释液100 μl(含250 000个细胞)分别加入阴性对照孔、阳性对照孔、A孔及B孔当中，然后将准备好的培养板放入37℃CO2培养箱孵育16-20 h;配制碱性磷酸酶标记的二抗;16-20 h后，从37℃CO2培养箱中取出96孔培养板，使用新鲜无菌的PBS液200 μl洗板4次;将培养板加入酶标抗体工作液50 μl后，用保鲜膜将培养板包好，放入4℃冰箱中再次孵育1 h。再次使用PBS洗涤4遍用于清除未结合酶标，50 μl底物工作液分别加入96孔，在室温温度下反应，反应过程中需避光，反应时间为7 min，反应结束后使用蒸馏水反复冲洗培养板以终止反应，最后在37℃2-3 h干燥培养板。待培养板干燥后，利用斑点计数仪进行计数。

1．3．2 结果判定 试验有效判定标准:试验设有阴性对照、阳性对照，ESAT-6和CFP-10作为两个实验孔，当计数结果为阴性对照孔内斑点数＜10、阳性对照孔内斑点数＞20时，判定实验结果有效。

阳性判定标准:当阴性对照孔内斑点数＜6时，且任何一个实验孔斑点数减去空白对照孔斑点数后≥6，则实验结果可判定为阳性。当阴性对照孔内斑点数＞6，且任何一个实验孔斑点数大于阴性对照孔斑点数的2倍，则实验结果可判定为阳性。

阴性判定标准:如若出现实验有效、阳性对照孔结果良好，但ESAT-6孔和CFP-10孔均达不到阳性标准的情况，则实验结果仍然判定为阴性。

1．3．3 统计学分析 首先将入选患者所有临床资料及T-SPOT．TB检测结果输入Excel表，建立数据库，依据四格表法计算T-SPOT．TB在结核性胸膜炎中的灵敏度(Sn)、特异性(Sp)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(LR+)、阴性似然比(LR-)。

2 结果

2．1 一般资料

实验组182例患者中仅12例胸水查见抗酸杆菌为阳性，45例患者行胸膜组织病理活检找到多核巨细胞或呈肉芽肿改变，6例患者行胸腔镜检查镜下表现，符合结核干酪样改变，其余119例则为临床上诊断的结核性胸膜炎。对照组129例患者，恶性胸腔积液73例均为病理诊断恶性胸腔积液，其中肺腺癌39例，肺鳞癌7例，肺小细胞癌9例，胸膜间皮瘤8例，淋巴瘤4例，肺外转移癌6例;肺炎旁积液41例;脓胸8例;结缔组织病引起的胸腔积液7例。

2．2 T-SPOT．TB 试验结果

本项研究患者共311例，均进行外周血 TSPOT．TB检测，检测结果见表1。实验组182例，其中阳性为160例，阴性为22例;对照组为129例，其中阳性者为25例，阴性者为104例。T-SPOT．TB试验诊断结核性胸膜炎的灵敏度为86．5%，特异度为82．5%，阳性预测值为 87．9%，阴性预测值为80．6%，阳性似然比为4．95，阴性似然比为0．16。

表1 结核性胸腔积液患者与T-SOPT．TB筛查结果的关系Table 1 T-SOPT．TB results of pleural effusion in patients with tuberculous pleurisy and non-tuberculous pleurisy

2．3 ESAT-6和CFP-10结果比较

在结核性胸膜炎诊断中ESAT-6的灵敏度为77．5%，特异度为 85．3%，阳性预测值为 88．1%，阴性预测值为72．8%，阳性似然比为5．27，阴性似然比为0．26。CFP-10的灵敏度为79．1%，特异度为83．7%，阳性预测值为87．2%，阴性预测值为74．0%， 阳性似然比为4．85，阴性似然比为0．25(见表2)。

表2 ESAT-6、CFP-10、T-SPOT．TB筛查结核性胸膜炎的诊断效能Table 2 Diagnostic efficiency of ESAT-6，CFP-10 and T-SPOT．TB in sceening tuberculous pleurisy

3 讨论

由于近年来结核病疫情呈明显回潮，结核病已经成为全世界成年人的主要死亡原因之一。众所周知，细胞免疫反应和迟发型变态反应是结核病的免疫学应答中的两种形式。体内巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞(Th)、结核杆菌特异性抗原以及相关细胞因子(CK)等多因素共同作用，导致了结核病的感染与发病，这一观点已被众多研究所证实［5］。结核杆菌首次感染机体引发致敏后，机体内的T淋巴细胞转化成记忆T淋巴细胞，能在机体的免疫系统内存在相当长一段时间。当人体再次被结核分支杆菌入侵感染时，机体内原先存在的记忆T淋巴细胞遭特异性抗原的再次刺激，随之释放出分子信号，并增殖转变为效应T淋巴细胞。效应T淋巴细胞在MTB特异性抗原刺激下，多种细胞因子被分泌释放出来，如巨噬细胞激活因子、白介素-23(IL-23)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子、IFN-γ等。其中，IFN-γ是抗结核感染免疫中的关键性细胞因子这一点被越来越多的研究所证实［6］。

由此可推断，如果结核感染特异性效应T淋巴细胞，在致病性结核分支杆菌特异性抗原刺激下分泌IFN-γ等相关细胞因子这一过程能成功重复。同时，ESAT-6、CFP-10的刺激作用会致使血液中的效应T淋巴细胞分泌IFN-γ，如果某种检测手法检测捕获IFN-γ以证明其存在，那么就可以从根本上证实存在着结核菌感染。T-SPOT．TB基于此项理论完成检测。在此方法中，机体PBMCs受到ESAT-6和CFP-10这两种致病性结核杆菌特异性抗原的刺激。如果存在结核现症感染，则在体外的细胞培养阶段，结核感染效应T淋巴细胞与ESAT-6和CFP-10充分接触，随后分泌释放出大量细胞因子。然后使用ELISPOT技术检测获得特异性细胞因子IFN-γ分泌水平，进而证实结核感染在机体中存在与否。由于环境中的非典型分支杆菌和卡介苗中均不含BD1基因序列，然而结核分支杆菌的RD1基因序列合成ESAT-6和CFP-10这两种蛋白，而仅致病性MTB之中存在着BD1基因序列，所以将ESAT-6和CFP-10这两种结核感染的特异性抗原做为刺激物来进行T-SPOT．TB试验，保证了结核T细胞斑点试验诊断结核的高度特异性。此外，因其单细胞水平、活细胞功能检测、高灵敏度、高通量等诸多优点，酶联免疫斑点技术(ELISPOT)成为了目前细胞免疫水平的最佳检测技术，T-SPOT．TB的高度灵敏也从而得到有效保证，也是目前实验室检测T淋巴细胞反应最灵敏的方法。

T-SPOT．TB一经有关部门批准使用后，就被广泛应用于临床上结核感染的筛查、结核病诊断、治疗效果的评估，虽其不能明显区分活动性结核和潜伏期结核，但在结核性诊断上仍有广阔的前景［7］。本研究中的 T-SPOT．TB 试验，使用包括ESAT-6和CFP-10蛋白在内的两种特异性抗原，对机体外周血单核细胞进行刺激，并应用通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测特异性细胞因子IFN-γ和分泌T细胞数量，综合此两项测试结果来判断结核感染。

结核性胸膜炎是继淋巴结核病活动性结核分支杆菌感染的第二常见的肺外病变。结核杆菌由近胸膜的原发病灶直接进入胸膜腔和经过淋巴管或血行播散直接至胸膜腔是引起结核性胸膜炎感染的主要途径。结核性胸膜炎临床主要以儿童和青年多见，但也可发生于任何年龄，结核性胸膜炎是世界上最常见的单侧胸腔积液病因，大约占30%-60%。临床主要表现为发热(以低热为主)、患侧胸痛、气短、乏力、盗汗等症状。临床上多需与类肺炎性胸腔积液、恶性胸腔积液、风湿性胸腔积液等各种原因相鉴别。胸水涂片抗酸杆菌阳性、胸水结核分支杆菌培养阳性及干酪性肉芽肿组织病理学检测被认为是诊断结核性胸膜炎的金标准，由于胸水涂片和培养的阳性率较低，影像学缺乏特异性，有创病理检查有一定局限性，所以临床工作中结核性胸膜炎的诊断常常十分困难。

本项研究结果提示T-SPOT．TB在结核性胸膜炎的诊断中敏感性高，特异度强。说明T细胞斑点试验在结核性胸膜炎与非结核性胸膜炎的鉴别诊断中具有较好的作用。

意大利 Losic等［7］使用 T-SPOT．TB 试剂盒，对胸液及全血的单个核细胞经抗原刺激后的SFCS进行了检测，胸液T-SPOT的灵敏度为95%，特异度为76%。Lee等［8］在128例(活动性结核病87例，结核病低危群113例)中同时进行ELISPOT检查发现ELISPOT其灵敏度最高为96．6%。Kim等［9］随诊72例患者疑肺外结核患者，对他们进行T-SPOT．TB和PPD检测，结果T-SPOT．T的灵敏度为97%，PPD的灵敏度为47%。本研究与国外研究相比较，灵敏度略低，特异性较高，但仍可提示外周血T-SPOT．TB对结核性胸膜炎的诊断及鉴别诊断有较高价值，研究灵敏度略低于国外考虑为我国是结核高风险国家，结核性胸膜炎的发病率明显高于欧美发达国家，样本量较国外研究大等诸多种原因所致。

国内杜岩青等［10］对健康对照组、初诊结核性胸膜炎组、恶性胸腔积组、非结核性胸膜炎组进行了结核杆菌涂片检查、T-SPOT．TB、ADA、TB-Ab，T-SPOT．TB对结核性胸膜炎诊断的灵敏度为91．1%、特异度为90．6%、诊断准确率为91．3%。刘珍琼等［11］对58 例受试者(32例结核性胸膜炎患者和26例非结核性胸膜炎患者)评价T-SPOT．TB结果，灵敏度为81．3%，特异度为92．3%，阳性预测值为92．7%，阴性预测值为80．0%。王陵等［12］对25例受试者(10例结核性胸膜炎和15例非结核性胸膜炎)进行T-SPOT．TB试验，其灵敏度为90．0%，特异度为80．0%。王永生等［13］选取24例临床和放射学可疑胸膜结核患者为实验组、25例非结核性渗出性胸膜炎患者为对照组，分别对其胸水进行T-SPOT．TB试验，实验组阳性率为95．8%，对照组25例中T-SPOT．TB试验阳性20%;胸水T-SPOT．TB试验诊断结核性胸膜炎的灵敏度和特异度分别为95．8%和80%，阴性预测值为82．1%，阳性预测值为95．2%。韦海旭等［14］使用T-SPOT．TB、TST对实验组24例结核性疾病患者和对照组28例非结核性疾病患者进行检查，实验组中T-SPOT．TB检测阳性达20例，阳性率为83．3%;对照组28例患者中27例T-SPOT．TB为阴性，诊断率为96．4%。周乐亮等［15］对24例确诊结核性腹膜炎的患者进行T-SPOT．TB检查，其中T-SPOT．TB检测阳性22例，T-SPOT．TB的灵敏度为92%。根据研究结核提示，T-SPOT．TB诊断TBP的灵敏度与结核菌素皮肤试验、外周血结核抗体检测、腹水腺苷脱氨酶测定结果进行比较，有统计学意义。17例患者被诊断为非结核性腹膜炎，行T-SPOT．TB检查，结果为阳性4例，阴性13例，特异度为77%;TST皮试，阳性5例，阴性12例，TST皮试诊断TBP的特异度为70%;血清TB-Ab IgG检测，阳性6例，阴性11例，血清TBAb IgG诊断TBP的特异度为79%。Liu等［16］对168例胸腔积液患者进行了前瞻性研究，胸腔积液TSPOT．TB检测结果显示其灵敏度为94．5%，特异度为76．1%。Zhang等［17］通过对167 例胸腔积液患者的前瞻性研究，同时应用T-SPOT．TB检测了患者胸腔积液和外周血，结果显示T-SPOT．TB胸水的灵敏度和特异度明显高于外周血，并且斑点数相比于外周血提高了3．6倍，研究结果表明，在结核性胸膜炎疾病诊断方面，胸水T-SPOT．TB具有更大的意义。本项研究结果中外周血T-SPOT．TB诊断灵敏度与上述国内的同类研究大致相符，但与国外同类研究相比略低，特异度与国外的同类研究相比略高，这可能由于中国人群中基础结核潜伏感染率较高所导致。ESAT-6、CFP-10是结核感染后特异性抗原抗体，检测其在结核性胸膜炎中的诊断价值，两者灵敏度、特异性无明显差异，联合检查时即可提高灵敏度。

综上所述，T-SPOT．TB试验在诊断结核性胸膜炎时，灵敏度、特异度高。在鉴别结核性胸膜炎和非结核性胸膜炎方面也具有一定意义。外周血TSPOT．TB试验操作简便易行，24-48 h检测结果即可回报。T-SPOT．TB的应用不仅可使患者得到早期诊断，还可以给临床医师提供有力参考，指导临床实践，及时治疗、避免误诊、节省医疗费用。但TSPOT．TB检测试剂盒价格昂贵，检测一次的费用大约需要500-600元，因此目前在我国没有常规应用于对结核病的筛查，在胸腔积液的诊断中，只用于对结核性胸膜炎和恶性胸腔积液难以鉴别时。

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