GC/MS 衍生化法检测血中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺

张大雷 ，张吉林，才志成，陈 奇，廖林川

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，成都 610041；2.黑龙江省公安厅刑事技术总队，哈尔滨 150008；3.哈尔滨商业大学药物研究所，哈尔滨 150076）

4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺（2C-B）1974 年由Alexander Shulgin 首次合成并发现其有精神作用[1]。上世纪90 年代开始，一些国家先后发现该物质出现被滥用的情况，随即WHO 和美国、瑞士等国家相继将其列为管制药品并禁止使用[2-4]；我国于2001 年将其列入Ⅰ类精神药品品种目录[5]。有报道称该化合物具有兴奋和致幻双重精神作用，强度是4-溴-2, 5-二甲氧基苯丙胺强的10 倍。随着服用剂量的升高，首先出现兴奋、松弛、消极的精神感觉，并随着剂量的增加不断增强，同时各种感官出现不同程度的欣快、兴奋，最后直至出现幻觉或达到妄想的状态，持续时间可达到6h左右，会引起身体严重的毒性副作用[1,3,6]。4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的化学结构见图1。

图1 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的化学结构Fig.1 Chemical structure of 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine

目前国际上对生物检材中的4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的检测方法报道不多，主要是采用液-液或固相萃取的方法提取生物检材后，采用气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC/MS）分析4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺原体成分[6-9]。国内尚无血液中检测方法报道。鉴于生物检材的基质干扰及该化合物的信号响应低等情况，为提高检验的灵敏度，本文拟建立衍生化GC/MS 法检测血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的方法，为今后法医毒物分析和吸毒人员检测提供灵敏、快速的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪 器：7890A/5975C 气 质 联 用 仪， 配EI源（美国Agilent 公司）；TJ-6 高速离心机（美国BECKMAN 公 司）；VORTEX-GENIE 2 旋 涡 混 合器（美国Scientific Industries 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；AB135-S 分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，0.01mg）；pH 计（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；DSY-Ⅱ型自动快速浓缩仪（北京金科精华苑技术研究所）；CNW 12 固相萃取装置（德国CNW 公司）；Bond Elut Centify®SPE 柱（填料：C8 和苯磺酸，3mL，美国Agilent 公司）。

试剂：4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺盐酸盐（纯度95%，黑龙江大学化学化工学院合成）；4-苯基丁胺（SIGMA-ALDRICH 公司，纯度 98%，密度 0.944）；甲醇、二氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯（DIKMA 公司）；氨水、三氟乙酸酐、NaH2PO4（SIGMA-ALDRICH 公司）。

1.2 色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱：Agilent DB-1MS（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升温：110 ℃开始，保持2min，以10℃/min 升至280℃，保持15min；进样口温度：250℃；载气：高纯He，流速1mL/min；进样量：1μL。

质谱条件: MSD 传输线温度270℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子轰击源能量：70eV；溶剂延迟时间：3.5min；全扫描模式（40～500，m/z）；选择离子扫描 m/z 242（4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺），m/z 91（4-苯基丁胺）。

1.3 溶液配制

标准溶液：精密称取4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺盐酸盐0.01201g 于10mL 容量瓶中，甲醇定容，配成浓度为1mg/mL 的标准储备液；临用时用甲醇稀释 成0.5，25，50，100，150，200，250μg/mL 的 系列浓度的标准工作液。

内标溶液：精密称取4-苯基丁胺2.700mL 于25mL 容量瓶中，甲醇定容，配成浓度为0.1 mg/mL的内标工作液。

1.4 样品处理

提取：取血液样品0.5mL，加入2μg 4-苯基丁胺（内标），去离子水稀释4 倍，8000r/min 离心20min，取上清液，加入NaH2PO4缓冲溶液（pH 值为6.0）2mL，混匀。

净化：依次用2mL 甲醇，2mLNaH2PO4缓冲溶液（pH 值为6.0）活化固相萃取柱。将处理过的血液样品加载过柱后，依次用1.0 mol/L 乙酸溶液1mL，去离子水3mL 淋洗，甩干小柱；再用甲醇6mL 淋洗，8000r/min 离心5min，甩干小柱；3mL 二氯甲烷/异丙醇/氨水（78/20/2，V/V/V）混合溶液洗脱，40℃空气流下挥干。

衍生：向挥干洗脱液的试管中加入乙酸乙酯、三氟乙酸酐（TFAA）各30μL，密封，60 ℃水浴30min，取出挥干，50μL 乙酸乙酯定容。

2 结 果

2.1 总离子流色谱图

空白血液中添加一定浓度4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺工作液和内标，按1.4 项操作，研究了不同初始温度和升温速率对检测结果的影响，得到1.2 项条件符合4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺检测的需要，见图2。同空白血液同法操作后比较，结果为4-溴-2,5-二甲氧基苯乙胺衍生产物和内标4-苯基丁胺衍生产物的保留时间分别为13.3min 和8.7min，理论塔板数按4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生产物计算不低于1.0×104，血液中内源性物质不干扰4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和内标的检测。

2.2 质谱分析

在优化好的条件下，分析后得到4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生产物和内标4-苯基丁胺衍生产物的特征质谱图，如图3。采用选择离子监控模式（SIM）进行定量分析，其定量离子分别为m/z 242 和m/z 91。

2.3 线性关系及检测限

精密量取空白血液0.5mL，分别加入不同浓度的4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺系列标准溶液20μL、内标工作液20μL，制成血浆中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺浓度分别为0.02、1、2、4、6、8、10 μg/mL的血液添加样品。按1.4 项下方法操作处理，分别记录分析所得数据。以4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺浓度为横坐标，4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺与内标物峰面积比值为纵坐标，以最小二乘法回归运算，得到标准曲线回归方程为Y = 0.299X + 0.05，r = 0.9993。结果表明，4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺在此色谱条件下0.02～10μg/mL 浓度范围内，线性关系良好，可以满足临床药物监测和法医毒物分析实际工作需要。

按信噪比为1: 3 确定最低检测限、信噪比为1: 10确定定量限。测得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺最低检测限为6ng/mL，定量限为17ng/mL。

2.4 精密度与稳定性

取空白血液0.5mL，按照2.3 方法配制4-溴-2,5-二甲氧基苯乙胺高、中、低3 个浓度（分别为10、4、0.02μg/mL）的质控样品，按1.4 项操作处理，测定3d，得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺与内标物峰面积比值，按照线性回归方程计算准确度、日内和日间精密度。结果见表1，高、中、低浓度（10、4、0.02μg/mL）血样测定准确度分别为101%，95%和97%，日内和日间RSD 均小于10%。

表1 血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的精密度、提取回收率（n=5）Table 1 Precision and recovery of 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine in human blood (n=5)

2.5 回收率

取空白血液0.5mL，按照2.3 方法配制4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺高、中、低3 个浓度（分别为10、4、0.02μg/mL）的血液样品各5 份，按1.4 项操作处理，得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生物峰面积A1。取空白血液 0.5mL，直按1.4 项操作处理后，添加相应4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺标准工作液各5 份，衍生化、吹干、溶解后进样，得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生物峰面积A2。

回收率公式为：回收率= A1/ A2×100%。按照公式计算，测得的回收率见表1，平均回收率为69.5%。

3 讨 论

本方法选用应用广泛的GC/MS 作为分析仪器，适应当前药物检测和法医毒物分析工作的需要，经过反复进样分析，确定起始温度为110℃，升温速率不宜过快，为10℃/min，较好地保证了被检测组分的完全分离。结果表明，GC/MS 对该化合物的响应值好，检测灵敏度高，适用于血液样品中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺成分的分析。

4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺属于苯乙胺类化合物，由于结构中含有氨基，化合物呈碱性，选用阳离子交换SPE 柱进行样品的提取、净化处理，可消除血液中酸性、中性化合物对检测的干扰。Theobald DS 等曾报道过体内生物样品中碱性药品使用碱性阳离子交换SPE 柱进行样品的前处理方法，这与本方法选用varian Bond Elut Centify®SPE 柱处理样品的原理相同[10-12]。本研究选用该SPE 柱处理4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺可以达到较好的样品前处理效果，血液添加样品的提取回收率高，效果较好。

图2 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺（1）和4-苯基丁胺（2）血液样品总离子流图。A：空白血液； B：血液 + 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和4-苯基丁胺。Fig.2 Total ion chromatography of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (1) and 4-Phenylbutylamine (2) in blood. A: blank blood; B: blank blood + 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine and 4-Phenylbutylamine.

图3 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺TFAA 衍生物（A）及4-苯基丁胺TFAA 衍生物（B）质谱图Fig.3 Mass spectra of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (A) and 4-Phenylbutylamine (B) derivatives with TFAA

三氟乙酸酐作为常用的衍生化试剂运用于本方法中，不仅可以提高产物的气化效果，而且可以增加质谱的响应值，进而提高了检测灵敏度。有报道称应用三氟乙酸酐衍生化的方法检测生物样品中甲基苯丙胺、氯胺酮等毒品成分，使检测的灵敏度有较大提高[13-14]。研究选用三氟乙酸酐作为衍生化试剂，衍生化产物产率高、稳定性好，其他干扰物质衍生化产物不影响4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺定性、定量分析。

目前，4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺作为新兴毒品成分，已在我国发现并有逐步扩大滥用的趋势。建立血液样品中该成分的分析方法势在必行，本研究建立了固相萃取方法提取、净化血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺成分，采用衍生化GC/MS 全扫描方法进行定性分析，选择离子模式进行定量分析。方法简便、灵敏、可靠，适用于吸毒人员临床药物监测和法医毒物分析的需要。

[1] Shulgin A, Shulgin A. Pihkal. A chemical love story [M].Berkeley: Transform Press, 1992. 503-506.

[2] Giroud C, Augsburger M, Rivier L, et al. 2C-B: A new psychoactive phenylethylamine recently discovered in ecstasy tablets sold on the swiss black market [J]. J Anal Toxicol, 1998, 22(5): 345-354.

[3] Boer D, Bosman I. A new trend in drugs-of-abuse: the 2C-series of phenethylamine designer drugs [J]. Pharm World Sci, 2004, 26(2): 110-113.

[4] Babu K, Boyer EW, Hernon C, et al. Emerging drugs of abuse [J]. Clin Ped Emerg Med, 2005, 6(2): 81-84.

[5] 张润生，龚飞君，曾立波，等. 气相色谱-质谱法检测精神药品2C-B 和芬特明[J]. 质谱学报，2004，25(增刊):147-148.

[6] 于忠山，张春水，王朝虹，等. BDMPEA 毒品的GC/MS 分析[J]. 刑事技术，2004(1): 13-14.

[7] Kanamori T, Inoue H, Iwata Y, et al. In vivo metabolism of 4-Bromo-2, 5- dimethoxyphenethylamine (2C-B) in the rat: Identification of urinary metabolites [J]. J Anal Toxicol,2002, 26(2): 61-66.

[8] Carmo H, Boer D, Remiao F, et al. Metabolism of the designer drug 4-bromo-2, 5- dimethoxyphenethylamine(2C-B) in mice, after acute administration [J]. J Chromatogr B, 2004, 811(2): 143-152.

[9] Pichini S, Pujadas M, Marchei E, et al. Liquid chromatography-atmospheric pressure ionization electrospray mass spectrometry determination of "hallucinogenic designer drugs" in urine of consumers [J]. J Pharmaceut Biomed,2008, 47(2): 335-342.

[10] 裴茂清，王俊新，伍海亮. 固相萃取法在苯丙胺类药物提取中的应用[J]. 刑事技术. 2002, 4: 21-22.

[11] 邸玉敏，朱军，常靖，等. SPE-GC/MS、GC/NPD 法检测血液中苯丙胺类毒品[J]. 刑事技术，2010, 3: 11-14.

[12] Rohanova M, Palenicek T, Balikova M. Disposition of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (2C-B) and its metabolite 4-bromo-2-hydroxy-5-methoxyphenethylamine in rats after subcutaneous administration [J]. Toxicol Lett,2008, 178(1): 29-36.

[13] 李雯佳，廖林川，陈礼莉，等. GC 法检测血液和尿液中甲基苯丙胺和咖啡因[J]. 中国法医学杂志，2009,24(1): 11-14.

[14] Weinmarm W, Renz M, Vogt S, et al. Automated solid-phase extraction and two-step derivatisation for simultaneous analysis of basic illicit drugs in serum by GC/MS [J]. Int J Legal Med, 2000, 113(4): 229-235.