基于ITS2 条形码序列对新型“香料”毒品植物成分的研究

杨雪莹，曹海丹，裴 黎，徐 鹏

（1.公安部物证鉴定中心 法医遗传学公安部重点实验室，北京100038；2.长春理工大学，长春 130022）

近期在世界很多国家和地区出现一种新兴毒品，形态与茶叶相似，吸食方法与大麻（Cannabis sativa）相同，燃烧会挥发出类似四氢大麻酚的物质（THC），其主要成分是JWH-073（1-丁基-3-（1-萘甲酰基）吲哚）和JWH-018（1-戊基-3-（1-萘甲酰基）吲哚）的一种烷基同系物。这两种化合物均为合成大麻素，能够与大麻素类似的受体结合，产生的效力比天然大麻强4～10 倍，能够迅速地从肺部转移到血液，到达全身各器官，吸食者可出现呕吐、妄想、精神恍惚和情绪失控等症状，严重者会感到呼吸困难、心跳加速、激动和瞳孔放大等。这种毒品由多种植物混合制成，吸毒者把它称作“香料”[1-3]。本研究使用DNA 条形码鉴定技术，采用ITS2 DNA 条形码片段，对新型“香料”毒品的植物成分进行鉴定研究，为“香料”毒品中有效成分的分析提供更确切的信息。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料为某市查获的疑似毒品物质，查获的部分样品外包装袋上标识为“spike 99”，“K2”，“7 号”。样品均为干燥植物成份，“K2”取两种不同颜色样本各1 份（“K2”-1, “K2”-2）、“spike 99”、“7 号”各取1 份，每种样本各取30mg，研磨成粉末，利用QIAGEN DNeasy plant mini kit 提取基因组DNA。

1.2 PCR 扩增及序列测定

采用正向引物5'-GCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向引物5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'扩增ITS2 片段。PCR 反应总体积为25μL，体系内含PCR mix 12.5μL（Tiangen Biotech Co., 中国）、引物各1μL（2.5μmol/L），总DNA 1μL。PCR 反应程序为94℃，预变性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，40 个循环；72℃延伸10min。纯化PCR 产物并使用ABI公司的3730XL 测序仪（美国Applied Biosystems公司）进行双向测序[4-5]。

1.3 序列分析

将测序得到的峰图应用CodonCode Aligner V3.71（美国CodonCode 公司Dedham, MA）序列分析软件进行校正拼接，ITS2 序列用HMMer 注释法切除5.8S 和26S 端，保留ITS2 的全长，应用BLAST方法在NCBI 数据库中比对。

2 结果与分析

以植物样本基因组DNA 为模板，扩增ITS2 基因片段得到了清晰的PCR 产物，空白对照无条带，见图1。

图 1 测试样品PCR 产物电泳图。M：2000bp 分子量标准品；1-4 依次为“spike 99”、“K2”-1、“K2”-2、“7 号”PCR产物。Fig.1 Amplification of ITS2 from 4 samples. M: 2000bp molecular marker; Lane 1-4: “spike 99”，“K2”-1，“K2”-2，“7#”.

将PCR 产物纯化后经3730XL 测序仪进行测序，将序列用HMMer 注释法切除5.8 和26S 端，保留ITS2 的全长，最终得到5 条220～235bp 的序列。经BLAST 比对，同源性分析，发现所检测的样本“K2”-1 ITS2 片段序列与啤酒花（Humuluslupulus）ITS2 序列的同源性高达100%（见图2），“K2” -2 ITS2 片段序列与黄蜀葵（Abelmoschusmanihot）ITS2序列的同源性高达100%，“7 号” ITS2 片段序列与大麻（Cannabis sativa） ITS2 序列的同源性高达100%，“spike 99”ITS2 片段序列与紫花苜蓿（Medicago sativa）ITS2 序列的同源性高达100%。

图2 “K2”-1 ITS2 比对结果Fig.2 Sequence alignment of “k2”-1 with ITS2 sequences in NCBI database

3 讨 论

DNA 条形码技术是一种新兴的物种鉴定方法，因其操作简单、通用性强、技术统一，近年来逐渐成为物种鉴定研究的热门方法[6]。ITS2 序列是位于核基因的一小段序列, 该序列在绿色植物中分布广泛, ITS2 具有序列短、容易扩增、鉴定能力强等多个DNA 条形码应有的优点, 是植物的DNA 条形码研究中最受关注的序列之一[4]。

本研究基于ITS2 条形码序列针对案件中缴获的“spike 99”、“K2”、“7 号”物质中的植物成分进行DNA 提取，通过PCR 扩增，获得了高纯度的ITS2 基因片段，在Gen-Bank 通过BLAST 搜索、比对，确定“spike 99”中植物成分与紫花苜蓿ITS2 基因序列的部分片段的同源性高达100%；“K2”中检出两种植物成分分别与啤酒花、黄蜀葵的同源性为100%，“7 号”与大麻的同源性为100%。其中黄蜀葵与大麻外形相似，为毒品原植物大麻的易混淆品种，但它与紫花苜蓿、啤酒花均是有经济实用价值和药用价值的植物, 均不含有毒成分。针对本案例中缴获的“spike 99”、“K2” 、“7 号”物质中的化学成分应用GC-MS 方法分析结果显示，“K2”的主要活性成分是JWH-018, “spike 99” 主要的活性成分是JWH-073 和JWH-018，“7 号”的主要活性成分是大麻[7,8]。综上所述，在本研究中，“spike 99”、“K2”中未检出天然大麻成分，为非毒品原植物添加入人工合成大麻素成分制成的新型毒品，这与化学成分分析结果一致。由于研究样本量有限，而且形态不规则，应用传统形态学很难确定其植物成分，DNA 条形码技术因此成为植物形态学分类的有效补充，可为物种鉴定提供更准确的信息，相信随着该技术的日益成熟，将会成为各类案件中的未知植物样本鉴定的有效手段。

[1] 徐鹏，王一，钱振华，等.“K2”香料的GC/MS 检验1例[J]. 中国法医学杂志，2011，26(3) : 250-251.

[2] Uchiyama N, Kikura-Hanajiri R, Ogata J, et al. Chemical analysis of synthetic cannabinoids as designer drugs in herbal products [J]. Forensic Sci Int, 2010, 198(1-3): 31-38.

[3] Hiroyuki K, Nahoko U, Jun O, et al. Chemical constituents and DNA sequence analysis of a psychotropic herbal product [J]. Forensic Toxicol, 2010, 28(2): 77-83.

[4] Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J/OL]. PLoS One, 2010, 1(5): 8613.

[5] Gao T, Yao H, Song J Y, et al. Evaluating the feasibility of using candidate DNA barcodes in discriminating species of the large Asteraceae family [J/OL]. BMC EvolBiol,2010(10): 324.

[6] Hebert P D, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identification through DNA barcodes [J/OL]. ProcBiolSci, 2003,270(1512): 313-321.

[7] 徐鹏，李晓娜，刘克林，等. 超快速液相色谱法测定新型“K2”香料中JWH-018 的含量[J]. 中国药物依赖性杂志，2012, 21(4) : 282-284.

[8] 徐鹏，王一，钱振华，等. 新型香草香料“毒品”的GC/ MS 检验1 例[J]. 刑事技术, 2011(3): 60-61.