续断煮散颗粒煎煮工艺正交试验与溶出曲线的研究

唐安玲， 宋 英 ， 李圆圆， 王聪颖， 贺宝莹

(1. 成都中医药大学，四川 成都610075;2. 成都中医药大学附属医院，四川 成都610072)

续断为川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall. ex Henry 的干燥根，其味苦、性微温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效，临床上主要用于腰背酸痛，肢节痪痹，损筋折骨，胎动漏红，血崩下血，以及遗精、带下、痈疽疮肿［1］。续断的有效成分有皂苷、生物碱、挥发油、多糖及其他生物活性成分［2］，川续断皂苷Ⅵ为续断药材及其制剂中的主要有效成分。中药煮散是指将中药饮片粉碎成颗粒与水共同煎煮后，去渣取汁而制成，它保持了传统汤剂的煎煮过程和疗效，能够很好的适应病情需要、随证加减，具有传统汤剂吸收快、疗效高的优点［3-4］。续断煮散颗粒是续断传统饮片经粉碎、加水挤出制粒、干燥等工序制成的单味中药煮散颗粒剂，是根据中药煮散机理而研制的新型中药饮片，其目的是保留其药性药效的同时，减少续断的用量和煎煮时间，提高续断的利用率［5-6］。本实验以干膏率和川续断皂苷Ⅵ量［7-8］为评价指标，通过正交试验和溶出曲线考察续断煮散颗粒的煎煮工艺，对续断煮散颗粒进行煎煮质量评价。

1 仪器与试药

HP-1100 高效液相色谱仪(美国惠普公司):惠普四元梯度泵，惠普自动进样器，惠普柱温箱;Hypersil BDS 色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特分析仪器有限公司);BP211D 电子分析天平(德国Sartorius 公司);XFB-400B 小型中药粉碎机(吉首市中诚制药机械厂);电热恒温水浴锅(双列八孔，北京市永光明医疗仪器厂);超声清洗器(AS10200，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

续断饮片(四川新荷花中药饮片股份有限公司，产地四川，批号1107292)，续断煮散颗粒(实验室自制)，川续断皂苷Ⅵ对照品(批号110724-200513，中国药品生物制品检定所，纯度为93.5%)。乙腈为色谱纯;水为超纯水(实验室自制);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交设计考察样品处理的煎煮条件

2.1.1 因素水平的确定 根据中药传统的煎煮方法和预试验结果，确定煎煮次数为2 次。选择加水量、浸泡时间、煎煮时间为主要的3 个考察因素，并制定每个因素下面的3 个水平。按L9(34)进行正交试验，以筛选出续断煮散颗粒的最佳煎煮工艺，因素水平设计见表1。

表1 续断煮散颗粒煎煮工艺的因素与水平

2.1.2 川续断皂苷Ⅵ的测定

2.1.2.1 色谱条件 Hypersil BDS C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm);流动相为乙腈-水(30:70);体积流量1.0 mL/min;柱温25 ℃;进样量20 μL;检测波长为212 nm;理论塔板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算应不低于3 000。

2.1.2.2 溶液制备 对照品溶液制备:精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品3.75 mg，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。供试品溶液制备:精密称取续断煮散颗粒5 g，按正交表方案进行试验，煎煮2 次，滤过，浓缩定容至200 mL。精密吸取正交药液2 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试溶液。阴性供试品溶液制备:吸取缺续断药液2 mL，同法制备阴性供试品溶液。

2.1.2.3 线性关系考察 分别取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液1、3、5、7、15 μL 进样，分别按“2.1.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以川续断皂苷Ⅵ色谱峰峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=2 156.04X -8.896 26 (r =0.999 96)。计算得出，在0.037 29 ～2.610 3 μg 范围内，川续断皂苷Ⅵ的进样量与峰面积呈良好线性关系。

2.1.2.4 精密度试验 取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液20 μL连续进样6 次，结果得到川续断皂苷Ⅵ对照品峰面积均值为606.1，RSD 为0.7%，表明仪器精密度良好。

2.1.2.5 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，按照“2.1.2.1”项下相应色谱条件，分别于制样后0、2、4、6、8、10 h 进样20 μL，记录峰面积，计算，结果样品中川续断皂苷Ⅵ峰面积均值为510.8，RSD 为0.6%，表明供试品溶液在10 h 内稳定。

2.1.2.6 重复性试验 对同一批样品溶液，按照“2.1”项下相应方法分别制备供试品溶液6 份，精密吸取各供试品溶液20 μL，按上述相应色谱条件测定，记录峰面积，计算得到川续断皂苷Ⅵ均值为1.437 mg/mL，RSD 为1.6%，表明该方法重复性良好。

2.1.2.7 加样回收率试验 精密量取已得含有量的样品制备溶液1 mL (川续断皂苷Ⅵ为1.437 mg/mL)于25 mL 的棕色量瓶中，共6 份，分别精密加入川续断皂苷Ⅵ对照品溶液(0.518 mg/mL)3 mL，按照“2.1”项下相应方法制备供试品溶液，按“2.1.2.1”项下相应色谱条件测定，通过计算，得出川续断皂苷Ⅵ的加样回收率平均值为99.3%，回收率在95% ～105%之间，RSD 为2.8%，表明该方法的准确度较好。

2.1.2.8 样品测定 分别精密吸取“2.1.2.2”项下制备的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液、续断煮散颗粒和传统饮片的供试品溶液各20 μL 进样，按“2.1.2.1”项下色谱条件测定。对照品及样品的色谱图如图1 所示。

图1 对照品及样品溶液色谱图

2.1.3 干膏收率的测定 精密吸取“2.1”项下各供试品溶液20 mL，分别置已恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，试验结果见表2。

2.2 正交试验设计与结果 根据续断煮散颗粒性质和临床疗效，选择川续断皂苷Ⅵ量和干膏收率为评价指标，进行综合加权评分。综合评分结果见表2。

从直观分析得出，综合得分与加水量关系密切，为最主要因素，其次是煎煮时间、浸泡时间;从方差分析结果得出(表3)，因素A (加水量)P ＜0.05，具有显著性，B(浸泡时间)、C (煎煮时间)不显著。为降低成本，节约能源，优选煎煮工艺为A3B2C3，即加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮20 min。

2.3 验证试验 为考察所选因素水平中最佳工艺的稳定性及可行性，按照最佳工艺条件进行3 次验证试验，取同一批号续断煮散颗粒25 g，共3 份，加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮2 次，每次20 min，药液定容至1 000 mL，按上述制备方法制备供试品溶液，并同法测定川续断皂苷Ⅵ量和干膏收率，结果见表4。

表2 煎煮工艺条件正交试验结果

表3 方差分析

表4 煎煮工艺验证试验结果

结果:川续断皂苷Ⅵ含有量均值为58.36 mg/g，RSD=2.25%，表明该工艺稳定可行，故确定优选的工艺为A3B2C3。

2.4 川续断皂苷Ⅵ溶出曲线比较 分别取8 份同一批号的续断传统饮片，每份精密称定5 g，用10 倍量水浸泡30 min 后，随机取4 份进行煎煮，分别在煮沸后5、10、20、30 min 时进行滤过，滤液定容至200 mL，作为样品溶液。剩下的4 份样品根据同样的方法分别在煮沸后30 min 时进行滤过，收集滤液备用，再向每份滤渣中加入10 倍量水，分别在煮沸后5、10、20、30 min 时进行滤过，合并两次滤液，再定容至200 mL，作为样品溶液。精密吸取上述溶液各2 mL 于25 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后的续滤液作为供试品溶液。用同样方法制备续断煮散颗粒的供试品溶液。精密吸取各样品溶液25 mL，分别置已恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。以川续断皂苷Ⅵ煎出量和干膏收率为评价指标，采用综合加权评分法，在不同煎煮时间点，对续断煮散颗粒及其传统饮片的煎出效率进行评分，绘制煎出曲线。见图2。

图2 续断煮散颗粒与传统饮片溶出曲线

将测定结果输入软件SPSS 13.0 进行统计分析，经配对t 检验处理后，得到P =0.000。即不同时间点续断煮散颗粒煎液中指标成分的溶出量都要高于续断传统饮片煎液，且差异具有极显著性(P ＜0.01)。

3 讨论

在优化续断煮散颗粒的煎煮工艺时采用正交试验法，确定方法为加20 倍量水，浸泡10 min，煎煮20 min。由于川续断皂苷Ⅵ是续断煮散颗粒的主要有效成分，其溶出量的高低对续断经配伍后的临床疗效影响较大，因此，选择川续断皂苷Ⅵ作为评价指标之一，权重系数相应较高，以0.6 为宜。干膏收率作为煎煮工艺的参考指标，能部分反映出续断煮散颗粒的干膏收率，但干膏收率与疗效不成正比例关系，故综合评价时权重系数相应较小，以0.4 为宜。

本研究在预试验时，对不同颗粒粒度(最粗粉、粗粉、中粉和细粉)制得的续断煮散颗粒进行煎煮考察，结果表明当续断粉碎成中粉和细粉时较易制粒，且颗粒饱满、色泽均匀，且容易滤过;通过对中粉和细粉制成的续断煮散颗粒煎煮过程中川续断皂苷Ⅵ溶出率和干膏收率的考察，续断饮片粉碎成中粉后进行制粒，出粉率较高，川续断皂苷Ⅵ含有量和干膏收率较高，具有较好的重复性和可操作性。故本研究选择续断中粉制得的煮散颗粒作为研究对象。

药材粒度在很大程度上会影响中药浸提过程中的渗透和扩散阶段，饮片粉碎后粒径大幅度减小，溶剂易于渗入颗粒内部，成分扩散速率增大，浸提过程加快。此为煮散颗粒能显著性提高饮片煎出效率的科学内涵。研究发现，单味饮片制备成煮散颗粒之后，其浸提效果相较于传统饮片有显著提高，故煎煮质量更高［11-13］。

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