正交试验结合抗菌活性实验优选野菊花的提取工艺

何志超， 李剑芳， 李国成， 王冬梅

(1. 中山大学孙逸仙纪念医院药学部，广东 广州510120;2. 中山大学药学院，广东 广州510080)

野菊花是菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L. 的干燥头状花序，其性微寒，味苦辛，入肝、肺经。具有疏风清热，解毒消肿，降血压等功效［1］，现代药理研究表明，野菊花具有良好的抗菌、消炎、抑制血小板凝集等作用［2-4］。有相关文献［5-7］报道了野菊花相关的正交试验，但仅从化学成分上予以考察，均未纳入活性实验指标。因此，为建立更加全面的野菊花提取工艺，提高提取物活性，本试验选择正交试验结合抗菌活性实验方法，优选野菊花的最佳提取工艺参数，为野菊花的进一步开发提供有益的参考。

1 仪器与材料

TU-1800PC 紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);BL310 电子天平(SARTORIUS 厂);三洋牌MLS-3020 高压灭菌锅;YJ-875B医用净化工作台(上海阳光实验仪器有限公司);PSH500A 生化培养箱(重庆实验设备厂);XSP-4C光学显微镜(上海光学仪器厂)。

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号为100080-200707)。乙醇、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钠均为分析纯。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黄曲霉，所用菌种均来自广州市微生物研究所。牛肉膏(上海长阳生化制药厂出品);蛋白胨(广东环凯微生物科技公司);琼脂粉(广东省科学微生物研究所)。

野菊花干燥花序，购自广州市清平药材批发市场。经中山大学药学院杨得坡教授鉴定为菊科植物野菊 (Chrysanthemum indicum L.)的干燥头状花序。

2 方法与结果

2.1 正交设计 根据预试验结果以及参考相关文献，以料液比(因素A)、乙醇体积分数(因素B)、提取温度(因素C)、提取时间(因素D)、pH 值(因素E)为考察因素，每个因素选择4 个水平，以野菊花总黄酮量、浸出物总量以及抑菌活性为评价指标，采用L16(45)正交表设计，每次实验重复3 次，具体因素水平详见表1。

表1 野菊花提取工艺正交试验因素水平Tab.1 Factors and levels for extraction of Chrysanthemum indicum L.

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制［8］精密吸取芦丁对照品溶液 (0.2 mg/mL)0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分别置于25 mL 量瓶中，各加入6 mL 蒸馏水，再加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀后放置后6 min，再次加入1% 硝酸铝溶液1 mL，摇匀后放置6 min，再加入4%氢氧化钠10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min 后。从700nm 至200nm 进行扫描，确定最大吸收波长为509.5nm。以吸光度A 为Y 轴，对质量浓度C 为X轴，绘制标准曲线。其回归方程为:A = 8.82 ×10-3C+1.13 ×10-2(r=0.998 5，P ＜0.001)。

2.2.2 总黄酮的测定 分别精密量取供试液5 mL置于25 mL 量瓶中，按标准曲线方法进行测定，显色，在509.5 nm 处测定吸光度A1，另分别精密量取供试液5 mL，置于25 mL 量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，在509.5 nm 处测定吸光度A2，取二次吸光度差值，由回归方程计算样品中总黄酮含有量。

2.3 抗菌活性的测定［9］严格按照CLSI 体外药敏试验操作规程，配制含有不同药物浓度 (0%、1%、2%、4%，m/V)的琼脂平皿，用微量移液器吸取适量提取物浓溶液置冷却至50 ℃左右的培养基中，迅速振摇使之混合均匀，倒入无菌培养皿中至厚度为4 ～5 mm，水平放置待凝。

菌液按要求配制，控制稀释浓度在1.5 ×106cfu/mL。用微量移液器吸取0.1 mL 菌液于培养基上，涂抹均匀。接种后培养基置37 ℃培养箱中培养，细菌于24 h 后观察结果，真菌于48 h 后观察结果。抗菌活性结果详见表2。

2.4 正交试验统计及结果分析 本正交试验应用SPSS17.0 进行正交试验结果分析，采用多指标进行统计分析，评分采用综合评分法进行处理。总的综合评分计算公式为:Yg*=ΣWk ×Ygk’，Yg*指第g 号试验的总评分;Wk 指权重(出膏率的权重为0.3，总黄酮提取率的权重为0.4，抗菌活性的权重为0.3)，Ygk’指第g 号试验K 项指标消除量纲后的评分。Ygk’ = (Ygk - Ykmin) × 100/(Ykmax-Ykmin)，Ygk 指第g 号试验k 项指标测量值;Ykmax指第k 项指标中的最大值，Ykmin指第k项指标中的最小值。正交试验结果见表3，方差分析结果见4，5。

表2 野菊花抗菌活性实验结果Tab.2 Results of antibacterial activities of Chrysanthemum indicum L.

由表3，5 可知，综合总黄酮量、浸出物总量以及抗菌活性3 个指标后，各因素对综合评分结果影响大小依次为B ＞C ＞A ＞E ＞D，其中乙醇体积分数对结果影响最大，确定最佳工艺为A3B3C4D2E4，即加入8 倍量50%乙醇后调整pH 至9，在80 ℃下回流提取4 h。

2.5 正交试验工艺验证试验结果 根据正交试验结果所得的最优工艺条件进行3 批次验证试验，具体详见表6。

表5 单因素统计量Tab.5 Results of estimated marginal means

表6 野菊花提取工艺验证试验Tab.6 Results of confirmatory experiment for extraction of Chrysanthemum indicum L.

结果显示所得的野菊花提取物出膏率、总黄酮量高，抗菌活性良好。提示正交试验所得的工艺符合实际，且结果稳定可靠。

3 讨论

3.1 评价指标的选择 中药提取系采用适当的溶剂和方法使中药所含的有效成分或有效部位浸出的操作，合理的提取工艺应最大程度保留有效成分以及提高提取效率［10］。本研究结合理化指标(总黄酮量、浸出物总量)以及药效学指标(抑菌活性)对野菊花提取工艺进行综合评价，尽可能做到全面反映提取工艺的优劣。

3.2 抗菌活性结果分析 本试验结果显示，对野菊花浸膏抗菌活性影响最大的因素为乙醇体积分数和提取温度。其中乙醇体积分数越高，提取温度越低，所提取浸膏的抗菌活性越高。并且不同条件提取的野菊花提取物均对供试细菌具有良好的抗细菌活性，在较低浓度下(1%)仍对供试细菌有明显的抗菌活性，与文献报道的野菊花有较强的抗细菌活性相符［11-13］。对于供试真菌，仅在高浓度时(3% ～4%)表现出一定的抗真菌活性，与文献报道不相符［12］，这可能与野菊花的提取方式不同相关。有报道显示［14］，相同的中药采用不同的提取方式，其提取物的抗菌活性会有显著差别，主要原因为不同提取方式导致各提取物的组成不相同，从而导致抗菌活性的差别。

3.3 结果分析讨论 根据所选取的因素水平考察结果，最终确定影响野菊花提取工艺的因素依次为:B ＞C ＞A ＞E ＞D，即乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞pH 值＞提取时间，各因素均具有统计学意义。

其中，乙醇体积分数和提取温度对提取工艺影响最大。适当的乙醇体积分数有利于溶解大部分的有机化合物，减少杂质的提取，使有效成分含量高。但同时随着温度的升高，抗菌活性有所下降，原因为野菊花部分抗菌活性成分对热敏感，如萜类化合物对高热敏感，会引起氧化或重排，造成结构的改变。

料液比、pH 值为次要影响因素。料液比对提取效率影响较大，随着料液比升高，提取率增大，这是因为溶剂越多，植物成分的溶出越多。而对于抗菌活性的影响，除了在1 ∶4 的水平下抗菌活性最强外，其余水平活性接近。由于溶剂越多，后期的减压浓缩所需的时间越长，提取液受热的时间就越长，这可能造成了抗菌活性成分的变性，所以抗菌活性有所下降。pH 对野菊花提取综合评价影响亦较大，野菊花含有大量黄酮类化合物，且多具有酚羟基，显弱酸性，在碱性条件下可提高其提取率。

提取时间影响最少。当提取时间由2 h 增加到4 h，提取率增加明显，随后增加提取时间对提取率以及抗菌活性影响不大。

本试验以野菊花总黄酮量，浸出物总量以及抗菌活性作为评价指标，优选野菊花最佳提取工艺，同时兼顾理化指标与药效学指标，较单纯理化指标的提取筛选工艺相对更科学、合理，且优化后所得条件相对稳定可靠，为进一步开发野菊花提供有益的依据。

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