医学实验室血清球蛋白不确定度评定

赵芳 季伙燕 李海泉 王建新 苏建友 沈荣春 王惠民▲ 邵可可

1.江苏省血液中心输血研究室，江苏南京210042；2.南通大学附属医院检验科，江苏南通226001；3.江苏省盐城市第一人民医院检验科，江苏盐城224001

医学实验室血清球蛋白不确定度评定

赵芳1，2季伙燕2李海泉2王建新2苏建友2沈荣春2王惠民2▲邵可可3

1.江苏省血液中心输血研究室，江苏南京210042；2.南通大学附属医院检验科，江苏南通226001；3.江苏省盐城市第一人民医院检验科，江苏盐城224001

目的以医学实验室血清球蛋白为例，研究如何用top-down法评定测量不确定度，为临床决策提供一定依据。方法应用top-down法评定不确定度，先评定出有证参考物质（CRM）总蛋白（TP）和白蛋白（Alb）的不确定度，再把这两项的不确定度合成，即为球蛋白（Glb）不确定度。结果浓度为70.10 g/L的TP、37.2 g/L的Alb的相对合成不确定度分别为1.77%、1.83%。Glb相对合成不确定度为2.55%，相对扩展不确定度为5.10%（k=2）。结论用top-down法评定Glb不确定度具有可行性，其可判断患者两次测量结果是否具有统计学差异，对患者的临床诊断和治疗具有潜在指导作用。

测量不确定度；血清球蛋白；偏移；期间不精密度

测量不确定度（measurement uncertainty，MU）简称不确定度，指根据所用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数[1]，是反映测量结果准确性的重要参数。MU在广泛计量领域应用已经很多年，但在检验医学应用较少。目前用于实验室的国际标准主要是ISO/IEC 17025《检测和校准实验室能力的通用要求》[2]，ISO 15189《医学实验室质量和能力的专用要求》[3]。在认可活动中，中国合格评定国家认可委员会（CNAS）等同采用的文件分别是CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则》[4]和CNAS-CL02《医学实验室质量和能力认可准则》，两者都要求提出评定MU[5]。建立参考体系的临床实验室必须按ISO 15193（Measurement of quantities in samples of biological origin-Presentationofreferencemeasurementprocedures）、ISO 15194（Measurement of quantities in samples of biological origin-Description of reference materials）[6，7]规范参考测量方法的应用、参考物质管理和实验室的管理，而且在这些活动过程中，都必须对测量不确定度进行评定。由于每个测量或校准结果必然受到某种因素的影响，而MU的评定提供了可能存在误差范围的信息，所以其可用于实验室向临床提供正确地解释和应用各种测量结果。杨振华教授曾指出：检验医学界在临床实验室各项检测结果不确定度如何进行计算[8]是应用“不确定度”时遇到的主要问题。本文自2013年来研究血清球蛋白（Glb）不确定度评定，可为临床肝脏疾病病变的严重性提供客观指标[9-12]，为临床医师诊断疾病、判断病情及预后提供重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

总蛋白为NIST的国际有证参考物质（TP SRM 927d），白蛋白为IRMM国际有证参考物质（Alb ERMDA470K/IFCC）。总蛋白（TP，双缩脲法）、白蛋白（Alb，溴甲酚绿法）测定试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司；室内质控品均购自美国（Bio-Rad）公司；校准血清购自英国（Randox）公司。Advia 2400全自动生化分析仪购自德国Siemens公司；德国Sartorius BT 25S电子天平（精度0.01mg）；Fluke-1521电子温度计；德国Eppendorf reference移液器；Millipore Direct-Q 3UV纯水仪；药勺、药杯、烧杯、容量瓶[13]。

1.2 方法

在临床生化检测中，Glb浓度=TP浓度－Alb浓度，因此Glb浓度测量不确定度为TP浓度不确定度与Alb浓度不确定度的合成不确定度。用top-down法[14]评定不确定度[15-19]时，不确定度分量包括偏移和实验室内重复性、期间不精密度或复现性，本论文采用期间不精密度。使用Excel 2007，运用公式对结果中的数据（正态分布下的定量资料）进行处理、分析。

1.3 血清白蛋白及总蛋白复溶

1.3.1 白蛋白（ERM-DA470K/IFCC）复溶实验前1 d下午将白蛋白（ERM-DA470K/IFCC）从冰箱中取出，在室温下平衡1 h。轻轻敲击试剂瓶，确保内容物完全落至试剂瓶底部。小心打开试剂瓶盖并拔出橡胶塞，将其放在电子天平上称量，待天平读数稳定后按“去皮”键置零。使用移液器沿瓶壁缓缓加入纯水，精确称量至（1.0000±0.0001）g。盖上橡胶塞及试剂瓶盖，在室温下复溶1 h后，轻轻混匀至少5次。将试剂瓶配制好的溶液置室温下静置12 h。使用前1 h内再轻轻颠倒混匀5次。

1.3.2 总蛋白（NIST 927d）复溶将总蛋白（NIST 927d）从-4℃冰箱取出平衡至室温后轻轻混匀数次。

1.3.3 白蛋白、总蛋白浓度测定按照常规测量系统标准操作程序，每次实验前用常规配套校准品对西门子Advia 2400全自动生化分析仪进行校准，校准通过后首先测量质控样本，如质控结果在允许范围内，则可对上述复溶的Alb和TP样本进行测量，每天测量3次，连续测量5 d。

1.4 白蛋白、总蛋白浓度偏移的不确定度及相对不确定度评定

与偏移相关的测量不确定度（ubias）分量包括偏移（b）、有证参考物质（CRM）的不确定度（uCref）及CRM测量重复性。

其中b为实验所得偏移的量值，x为重复测量CRM所得均值，为CRM的靶值。

其中uCref为CRM的标准测量不确定度，UCref为CRM的扩展不确定度，k为95%可信区间的包含因子。

其中sCRM为重复测量CRM的标准差，n为测量天数。依据不确定度传播律，如果实验室不修正偏移，应按公式（4）计算偏移的合成标准不确定度。

1.4.4 偏移的相对不确定度计算

其中ubias偏移的合成标准不确定度，xCRM为有证参考物质的靶值。

1.5 白蛋白、总蛋白期间不精密度评定

利用医学实验室的常规质控结果计算实验室内期间不精密度（CV）。根据澳大利亚生物化学学会（AACB）推荐，使用2013年1～6月份连续6个月的实验室内质控数据可计算实验室期间不精密度。按公式（6）计算CV。

1.6 白蛋白、总蛋白相对合成标准不确定度评定

根据不确定度传播律原则，将偏移的相对不确定度及期间不精密度进行合成即为相对合成不确定度，即

1.7 球蛋白相对不确定度评定

Glb浓度相对测量不确定度为TP浓度相对不确定度与Alb浓度相对不确定度的合成不确定度，根据不确定度传播律原则，Glb的相对不确定度为：

1.8 球蛋白相对扩展不确定度评定

相对扩展不确定度U由相对合成不确定度乘以包含因子（k）获得，本论文评定95%置信水平下的不确定度，因此k=2，则

2 结果

2.1 白蛋白、总蛋白浓度测定结果

在德国西门子Advia 2400全自动生化分析仪上，严格按照常规测量程序要求，测量TP和Alb浓度，每天重复测量3次，连续测量5 d，结果数据见表1。

2.2 白蛋白、总蛋白浓度偏移的不确定度及相对不确定度

根据1.2.3所述，偏移的不确定度包括偏移（b）、CRM的不确定度（uCref）、重复测量引起的不确定度S2CRM/n，运用公式（4）计算偏移的不确定度，运用公式（5）计算偏移的相对不确定度，测量计算结果原始数据见表1。

2.3 白蛋白偏移的不确定度及相对不确定度

2.4 总蛋白偏移的不确定度及相对不确定度

2.5 白蛋白、总蛋白期间不精密度

2.5.1 白蛋白的期间不精密度使用医学实验室2013年连续6个月的室内质控数据计算白蛋白的期间不精密度，具体数据见表2。

其中，SD1～SD6分别代表白蛋白2013年1～6月份室内质控数据的期间不精密度。

2.5.2 总蛋白的期间不精密度使用医学实验室2013年连续6个月的室内质控数据计算总蛋白的期间不精密度，具体数据见表2。

2.6 白蛋白、总蛋白相对合成标准不确定度

用top-down方法评定白蛋白、总蛋白的相对合成不确定度为偏移的相对不确定度与期间不精密度的合成值，具体结果数据见表3。

表1TP、Alb测量结果及相关数据

表2医学实验室TP、Alb室内质控数据

2.6.1 球蛋白相对合成不确定度根据公式（10）和表3中的数据计算球蛋白的相对不确定度。

表3TP、Alb相对合成不确定度

2.6.2 球蛋白相对扩展不确定度根据公式（11），计算血清球蛋白的相对扩展不确定度。

%U=%uc×k（k=2）

%UGlb=2.55%×2=5.10%

通过本研究得出血清球蛋白浓度的相对合成不确定度为2.55%，相对扩展不确定度5.10%（k=2）。当医师需要决定同一患者不同时间段的两个测量结果间是否有差异，通过不确定度评定就可以实现。

如某一患者第一次测量血清球蛋白浓度为30 g/L，再次测量升高为36 g/L，如果已知球蛋白合成不确定度是0.765 g/L，两次测量结果前后差异6 g/L，确实有差异吗？如果二次测量结果相比超出2.77×uc（Glb），即超出2.12 g/L，这样两次结果有统计学差异，此处高出6 g/L，说明该患者两次测量结果的差异有统计学意义。

3 讨论

血清球蛋白（Glb）是临床生化检验较为重要的指标。本研究主要用top-down方法对Glb测量不确定度进行评定，探讨测量不确定度在临床检验中的应用，为检验质量的持续改进提供重要依据。top-down法评定不确定度需要考虑偏移和不精密度两个分量，偏移可经过测定CRM，并将测定均值与靶值相减获得，不精密度评定可利用实验室内质控数据，因此topdown法评定MU适用于医学常规实验室。

在临床中对判定肝脏病理程度，测量Glb不确定度有一定的参考价值，而A/G值能更准确地反映肝脏病理程度。血清Glb对临床医师诊断疾病、判断病情及预后具有重要参考价值。因此，系统评定医学实验室Glb不确定度是十分有必要的。临床医师经常需要比较同一患者不同时间段检验报告测量结果，并分析判断两次测量结果差异是否有临床意义，通过比较测量结果是否大于2.77×uc即可判断，而通过不确定度评定还可判断患者检测结果是否超出参考范围，因此MU的评定具有一定的临床应用价值。

本文研究血清Glb的不确定度评估方法，并探讨其临床应用价值，研究相对而言比较局限，不仅是对Glb的测量不确定度评定的研究，而是为了在今后的工作中可以Glb不确定度评定方法为参考，对医学实验室的每一个检验项目的测量不确定度都进行评定，加强实验室与临床的联系，及时向临床提供检测结果的不确定度信息，从而帮助临床改进对患者结果的解释；进一步促进检验与临床的合作，从而更准确地利用检验结果诊断疾病，提高医疗水平和服务质量。

本研究以测量不确定度的相关理论[21，22]为基础，以血清Glb为研究对象，用top-down法对医学实验室常规生化检验项目的测量不确定度进行评定，并在如何评定偏移的不确定度和精密度方面进行了一些探索研究。主要运用top-down法评定医学实验室测量不确定度——基于正确度和实验室期间不精密度，使用一个有赋值和声称不确定度的国际有证参物质（CRM），通过实验、数据处理和分析，可靠地求得偏移（bias）及偏移的不确定度（ubias），再利用实验室室内质控数据求得实验室期间不精密度，最终通过不确定度传播律求得血清Glb的合成不确定度和扩展不确定度。并根据Glb不确定度评定结果判断患者不同次测量结果间是否具有统计学差异，从而确定了不确定度评定的临床应用价值。不确定度为实验室检测结果的可靠性提供了合理解释，对于患者的临床诊断和治疗具有潜在指导作用。

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Evaluation of measurement uncertainty of serum globulin in medical laboratory

ZHAO Fang1,2JI Huoyan2LI Haiquan2WANG Jianxin2SU Jianyou2SHEN Rongchun2WANG Huimin2SHAO Keke3
1.Research Room of Blood Transfusion,Jiangsu Blood Center,Nanjing210042,China;2.Department of Laboratory, Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong226001,China;3.Department of Laboratory,Yancheng First People’s Hospital in Jiangsu Province,Yancheng224001,China

ObjectiveTo study how to use the top-down method to evaluate the measurement uncertainty based on the seroglobulin in medical laboratories in order to provide certain reference for clinical decision making.MethodsThe top-down method was used to evaluate the uncertainty,which included evaluating the uncertainties of certified reference materials(CRM)such as total protein(TP)and albumin(Alb)at first and then combining the two uncertainties to get the uncertainty of globulin(Glb).ResultsThe relative combined uncertainties of 70.10 g/L of TP and 37.2 g/L of Alb were 1.77%and 1.83%respectively.The relative combined uncertainty of Glb was 2.55%and its relative expanded uncertainty was 5.10%(k=2).ConclusionThe application of the top-down method in evaluating Glb uncertainty is feasible,can determine if there exists statistical difference between patient’s two measurements,and it is of potential guiding effect on the clinical diagnosis and treatment for patients.

Measurement uncertainty;Serum globulin;Bias;Intermediate imprecision

R446

A

1673-9701（2015）27-0008-04

2015-06-03）

江苏省南通市科技项目（HS2012009）；国家质检总局公益性行业科研专项经费项目（201210066）

▲通讯作者