在Transwell 小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究*

张又枝，黄 琦，任 平

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院糖尿病及心脑血管病变湖北省重点实验室)

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在医药学的基础研究中应用广泛，主要是其比较易得到，而且又具有内皮细胞的特征，对疾病的发病机制的研究极为重要。但是该细胞比较脆弱，极易损伤，在研究中不易得到活力比较好的细胞。Transwell 小室是一种嵌入细胞培养板，其小室底部含有聚碳酸酯膜的材料，亦称为PET 膜，该膜根据孔径不同将其分为不同种的小室，但是共有的特点是其具有通透性，使小室内外培养液的成分相互影响，从而影响细胞的生长、运动等。由于其材料的通透性，主要应用在共培养体系，趋化性实验以及肿瘤细胞的迁移实验中［1～3］。本研究是类似于共培养体系的一种培养方法，选用PET 膜孔径为0.4μm 的小室，将HUVEC 细胞种于上室，细胞无法通过该孔径，分泌的因子可以在下室的培养液中检测出。

1 材料与方法

1.1 标本来源与采集 标本均来自于湖北省咸宁市中心医院正常足月妊娠娩出新生儿的脐带。新生儿娩出后于无菌条件下剪下脐带(约30～40cm)迅速放入装有无菌PBS 的容器中，放入冰盒中尽量在2h 内移入实验室，行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离培养。

1.2 试剂与仪器 ECM 培养基(Science cell);Transwell 培养板(Corning);乙二胺四乙酸(Sigma);胰蛋白酶(Sigma);明胶(Solarbio);青霉素，链霉素(Amresco);兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(武汉博士德生物工程公司);其他试剂均为国产分析纯。CO2细胞培养箱(厦门致微);超净工作台(苏净集团安泰公司);倒置荧光显微镜(日本Nikon);高压蒸汽灭菌锅(厦门致微)。

1.3 方法

1.3.1 胰酶消化法原代培养HUVEC 具体步骤如下 将三通管插入脐静脉内，并予以固定，用注射器吸取PBS 液从三通管的一端注入到脐静脉中，洗净脐静脉内的血液，直到流出的液体接近于PBS 的颜色为止;夹闭脐带另一端，不含EDTA 和含EDTA 的0.25%胰蛋白酶液体(体积比1∶1)沿三通管注入脐静脉，充满后关闭三通管，在超净台内常温消化30min;将止血钳松开，在出口的另一端插入一无菌的塑料管，将注入脐静脉内的胰酶液体引流入已装有10%FBS 的M199 培养基中，终止胰酶的消化作用;注入10%FBS 的M199 培养基，脐静脉另一端引流出培养基放于试管中;将收集于试管中的培养基和胰酶液体，以1000rpm的转速离心12min;吸弃上清液，用ECM 培养基(含内皮细胞生长因子，ECGS)重悬细胞，种入培养瓶中，静置培养;第二天，用含ECM(含ECGS)的培养基换液，以去除残余胰酶溶液及未贴壁细胞的影响。

1.3.2 HUVEC 的传代培养步骤 待细胞融合后，两瓶细胞分别用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)和0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，制成单细胞悬液，根据细胞的多少来决定传代比例，依细胞活力，将第2～10 代之间的细胞将其传代到Transwell 小室中用来做进一步的实验。

1.3.3 细胞免疫荧光技术对HUVEC 内皮细胞标志物Ⅷ因子鉴定 先将细胞种在放有玻片的24孔板或六孔板中贴壁过夜，倒掉培养基，再用PBS溶液清洗细胞两次，弃掉PBS，最后加4%多聚甲醛适量，固定10min;吸弃多聚甲醛，室温下PBS洗3 次;吸弃PBS，加入0.125% Triton，室温下破膜15min;PBS 洗5min ×3 次;5% BSA 或山羊血清封闭25min;加一抗(Ⅷ因子抗体，稀释度为1∶500)，然后将有一抗的培养皿放于湿盒中，于4℃孵育过夜;加FITC 标记的荧光二抗，37℃下避光孵育1h;PBS 洗涤5min×3 次;加DAPI(染核试剂)室温孵育2min;PBS 洗5min;荧光显微镜下观察照相并记录结果。

2 结果

2.1 原代人脐静脉内皮细胞鉴定 图1 是采用细胞免疫荧光化学技术检测内皮细胞标志物Ⅷ因子，结果显示:含有Ⅷ因子的细胞胞浆着绿色，胞核着蓝色。该结果提示通过胰酶消化法所得原代人脐静脉内皮细胞纯度比较高。

图1 人脐静脉内皮细胞鉴定

2.2 Transwell 小室中HUVEC 内皮细胞 结果表明，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化HUVEC细胞成细胞悬液将其种入Transwell 小室中，第2d仅有少许细胞贴壁，细胞形态较差。时间(大约2min)和温度(室温)相同的条件下，用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化HUVEC 细胞后，将其种入Transwell 小室中，6h 左右细胞贴壁，至第2d 仍生长良好。

3 讨论

人脐静脉来源丰富，且由于其具有动脉的特性，对于研究血管类疾病例如动脉粥样硬化等有其特有的优势，但是由于其比较娇嫩，在一般的培养瓶以及孔板中难培养，其培养条件及方法报道甚多，但是对于特殊支撑材料的培养条件鲜有报道。

本研究首先用胰酶消化法取得原代人脐静脉内皮细胞，其消化的胰酶的比例以及时间都是本实验室通过摸索得来的条件。我们用过别人相同的胰酶在室温下消化10min 但是得到的细胞很少;我们也用过别人的胰酶条件，即0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)或者是单纯用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化［4，5］，但是得到的细胞无论数量以及状态都没有本文中消化条件0.25%胰蛋白酶+EDTA 液体(1∶1)得到的细胞状态和数量佳。

然后从鉴别方法进行比较，从结果中得知，用免疫荧光法鉴定内皮细胞的标志物Ⅷ因子比用传统的DAB 方法染色更清晰、明显的标出阳性细胞(DAB 法结果未显示)。DAB 染色的胞浆Ⅷ因子的棕色斑块容易与背景混淆。绿色荧光在显微镜下很容易辨认，图片对比度更高。最后在特殊材料Transwell 的PET 膜上种植HUVEC 的培养条件也值得借鉴。就本实验结果得知，胰酶的选择是最重要的一个因素，尽量选择消化能力比较弱的胰酶即0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)，而含EDTA 的胰酶很容易将细胞消化过度，即使在显微镜下观察一样的时间，其消化过的细胞后来种在Transwell 小室内也几乎不能贴壁，最后死亡全漂浮起来。

总之，人HUVEC 用途广，而且现阶段对于利用特殊支撑材料进行的研究越来越多，本实验实验条件的摸索对于该细胞更广泛的研究应用有一定的借鉴意义。

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