响应面法对青稞红曲中两种Monacolin K 的提取工艺优化

谭友莉，马云桐，黄 凤，文 静，余志芳，欧 泉

成都中医药大学药学院 四川省中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，成都 611137

青稞红曲是红曲霉属真菌接种于青稞上发酵而成的一种麦曲。其含有的Monacolin K(即洛伐他汀)成分是对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶起抑制作用的物质［1］，具有降血压、降血脂、减少动脉粥样硬化发生、防治冠心病等作用［2，3］。在红曲中Monacolin K 以开环的酸型和内酯型两种形态存在［4］。据研究发现酸型Monacolin K 因能被人体直接吸收，发挥降脂作用，减少了肝、肾负担，而优于需在体内水解转化为开环型发挥药效的内酯型Monacolin K［5］。因此，有效提取青稞红曲中Monacolin K，并准确测定其两种形态的含量和比例，对开发该药物资源和体现其降脂作用具有重要意义。本文采用超声提取法，用响应面法对主要影响因子提取时间、温度和料液比之间的单一和交互作用等进行了较深入的研究，得出最佳提取青稞红曲中Monacolin K 的工艺参数，并采用HPLC 法同时测定内酯型和酸型Monacolin K 的含量及比例，为青稞红曲中Monacolin K 的开发利用提供理论依据。

图1 酸型和内酯型Monacolin K 的化学结构Fig.1 Chemical structures of acid form and lactone form of Monacolin K

1 材料与仪器

1.1 材料

青稞红曲(批号:20140605):由西藏月王生物技术有限公司提供。甲醇、乙腈为色谱纯［赛默飞世尔科技(中国)有限公司］，磷酸、氢氧化钠为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)，内酯型Monacolin K标准品(C24H36O50，99.4%，批号:100600- 201003;中国食品药品检定研究院)。

1.2 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪(G1322A 溶剂脱气器，G1311A 四元泵，G1315C 二极管阵列检测器);十万分之一天平［赛多利斯科学仪器(北京)有限公司］;JA1003 千分之一天平(上海舜宇平科学仪器有限公司);KQ5200E 超声清洗器机(昆山市超声仪器有限公司);DZKW-4 电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温:30 ℃，流动相:乙腈-0.1%磷酸水(60∶40，v/v)，流速1.0 mL/min，检测波长:238 nm，参比波长(400 nm)，进样量:10 μL，样品经0.45 μm 滤膜过滤后用HPLC 法测定。

2.2 对照品溶液及样品溶液的制备

2.2.1 内酯型Monacolin K 对照品

精密称定Monacolin K(内酯)标准品10.18 mg加入甲醇定容至100 mL，摇匀，作为内酯型洛伐他汀对照品溶液。HPLC 检测内酯型洛伐他汀保留时间在15.862 min。

2.2.2 酸型Monacolin K 对照品

称取Monacolin K(内酯)标准品20.10 mg，用含20%甲醇pH=12 的氢氧化钠溶液定容至100 mL，在50 ℃条件下超声转化1 h 自然冷却至室温。HPLC 检测发现转换后的酸型Monacolin K 只有一个峰，保留时间在8.673 min。

2.2.3 样品溶液的制备

取青稞红曲粉末(过三号筛)约1.0 g，精密称定，置100 mL 磨口锥形瓶，加20 mL 纯甲醇，称定重量，50 ℃超声提取1 h，放冷，再称定重量，用纯甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，4 ℃冰箱储存备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围

精密吸取0.2010 mg/mL 酸型和0.1018 mg/mL内酯型Monacolin K 对照品溶液2、5、10、15、20 μL，每个浓度进样3 次。以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:内酯型Monacolin K:Y=78.137X-26.171，相关系数r=0.9999;酸型Monacolin K:Y=25.484X+2.3171，相关系数r=0.9998。表明酸型Monacolin K 在40～300 mg/L 和内酯型Monacolin K 在10～200 mg/L范围内线性关系良好。

2.3.2 分离度实验

精密吸取2.2 项样品溶液和对照品溶液，按照2.1 项下色谱条件分别进样，如图2，在样品中两种Monacolin K 出峰时间和两种Monacolin K 标准品出峰时间吻合。在样品中内酯型Monacolin K 和酸型Monacolin K 分离度良好，且需要的色谱峰附近不存在干扰峰，两种类型Monacolin K 分离情况如下图2所示。

图2 样品中酸型和内酯型Monacolin K 的分离图Fig.2 HPLC chromatogram of highland barley Monascus

2.3.3 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，按上述2.1 项下色谱条件连续进样6 次，记录酸型Monacolin K 和内酯型Monacolin K 峰面积，结果酸型和内酯型Monacolin K 峰面积的RSD 分别为0.63%、0.82%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

按2.2.3 项重复制备6 份同一供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，计算，得酸型Monacolin K平均含量为0.26%，RSD 为0.53%，内酯型Monacolin K 平均含量为0.15%，RSD 为1.26%。结果说明，该检测条件重复性良好，满足样品检测的需要。

2.3.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在1、4、8、12、16、24 h进样，记录酸型和内酯型Monacolin K 峰面积，结果酸型Monacolin K RSD 为0.83%，内酯型Monacolin K RSD 为1.12%，表明在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取已知含量青稞红曲样品6 份，加入一定量酸型和内酯型Monacolin K 标准液进行回收试验。酸型Monacolin K 的平均回收率为99.6%，RSD 为0.24%;内酯型Monacolin K 的平均回收率为98.4%，RSD 为0.71%。

2.4 两种Monacolin K 提取单因素试验设计

在进行响应面分析之前，先通过单因素实验选出对青稞红曲中两种Monacolin K 提取得率具有显著影响的因素，并确定其试验水平。本文称取1.0 g青稞红曲，考察不同浓度甲醇(45%、55%、65%、75%、85%、100%)，提取温度(40、50、60、70、80℃)，提取时间(10、30、60、90、120 min)，液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)对青稞红曲中两种Monacolin K 提取得率的影响。

2.5 两种Monacolin K 提取响应面法实验设计与数据分析方法

以单因素试验的结果为基础，根据Box-Behnken试验设计原理，选取提取温度(A)、液固比(B)、提取时间(C)等对两种Monacolin K 提取影响显著的3个因素，在单因素试验的基础上采用3 因素3 水平的响应面分析方法。具体试验因素与水平设计方案见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

采用Design-Expert 8.0 软件对实验数据进行回归分析，拟合二次多项式方程。多项式模型方程拟合可靠性R2越接近1，则多项式模型与实际拟合可靠性越高，其统计学上的显著性由F 值检验，F 值越大表明该变量对因变量的影响越显著;因素的线性效应、平方效应及其交互效应的显著性由模型系数的P 值检验，概率P 值越小，则相应的显著程度越高，P＜0.01 时影响为极显著，P＜0.05 影响显著。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取溶剂对青稞红曲中两种Monacolin K 得率的影响

设定提取温度50 ℃，液固比20∶1 mL/g，超声提取2 h，分别以45%、55%、65%、75%、85%、100%不同浓度甲醇作为提取溶剂，测定两种Monacolin K 的峰面积。结果表明，甲醇浓度越高两种Monacolin K 提取得率越高。使用纯甲醇提取溶液所得的酸型Monacolin K 的平均得率为0.233%;内酯型Monacolin K 平均得率为0.153%。采用纯甲醇提取样品，色素含量低，能保护柱子;不需要蒸干溶剂再定容，过滤容易;因不含水，酸型和内酯型Monacolin K 稳定性更好，含量更确定可靠。故采用纯甲醇提取青稞红曲种两种Monacolin K。

3.1.2 提取温度对青稞红曲中两种Monacolin K 的得率的影响

设定纯甲醇为提取溶剂，液固比为20∶1 mL/g，超声提取时间为2 h 条件下，在40、50、60、70、80℃温度下，分别测定两种Monacolin K 的峰面积，结果表明在60 ℃左右时，两种Monacolin K 的得率达到最值。因此选择温度为60 ℃左右为宜。

图3 提取温度对得率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction yield of Monacolin K

3.1.3 液固比对青稞红曲中Monacolin K 的得率的影响

设定在60 ℃下，纯甲醇为提取溶剂，超声提取时间为2 h，以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)液固比，分别测定两种Monacolin K 的峰面积，结果表明液固比为20∶1 mL/g 附近时两种Monacolin K的得率达到最值之后提取得率略有下降。因此液固比选择在20∶1 mL/g 左右。

由于不带蓄电池备电，所以在没有市电的情况下，这种供电方式不能为信号源提供电能。综上所述，直流输入不带备电的方案比较适合于信号源为直流输入，对服务要求不高的场景。

图4 液固比对得率的影响Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of Monacolin K

3.1.4 超声提取时间对青稞红曲中Monacolin K 的得率的影响

设定60 ℃下，以纯甲醇为提取溶剂，液固比20∶1 mL/g，分别提取10、30、60、90、120 min，分别测定两种Monacolin K 的峰面积，结果表明，两种Monacolin K 得率随时间的增长呈上升趋势，60 min 附近达到最大之后趋于平缓，为减少能耗，节约时间，提取时间选择在60～70 min 之间。

图5 提取时间对得率的影响Fig.5 The effect of extraction time on the extraction yield of Monacolin K

3.2 响应面法优化青稞红曲中两种Monacolin K 提取工艺

3.2.1 响应面分析方案与结果

对两种Monacolin K 提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见表2。

表2 试验分析方案及实验结果Table 2 Box-Behnken design arrangement and the experimental results

采用Design-Expert 8.0 软件进行二次回归响应面分析，得到Monacolin K 得率Y 对提取温度A、液固比B、提取时间C 的二次多项回归模型:

酸型Monacolin K 得率:Y1=2.47-0.0025A+0.041B+0.069C-0.050AB-0.020AC+0.052BC-0.096 A2-0.11B2-0.22C2

内酯型Monacolin K 得率:

各因素的方差分析见表3、4。

表3 酸型Monacolin K 提取的二次响应面回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model of extracting acid form Monacolin K

表4 内酯型Monacolin K 提取的二次响应面回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model of extracting lactone form Monacolin K

从表3 可以看出，Y1模型P=0.0003＜0.01，此时Y1回归模型极其显著，表明该试验方法可靠。失拟项P=0.1015＞0.05，检验为不显著，说明Y1回归模型与实测值能较好的拟合。Y1模型相关系数R2=0.9656，表明可信度良好;=0.9213，说明92.13%的实验数据可用该模型进行解释。综上，Y1模型可以对酸型Monacolin K 提取工艺进行分析和预测。从F 值可以看出，影响酸型Monacolin K 得率的各因素按影响大小排序依次为C(提取时间)、B(液固比)、A(提取温度)，其中C 达到极显著水平。

从表4 可以看出，Y2模型P=0.0001＜0.01，此时Y2回归模型极其显著，表明该试验方法可靠。失拟项P=0.1239＞0.05，检验为不显著，说明Y2回归模型与实测值能较好的拟合。Y2模型相关系数R2=0.9737，表明可信度良好;=0.9399，说明93.99%的实验数据可用该模型进行解释。综上，Y2模型可以对内酯型Monacolin K 提取工艺进行分析和预测。从F 值可以看出，影响内酯型Monacolin K得率的各因素按影响大小排序依次为C(提取时间)、B(液固比)、A(提取温度)，其中C 几乎达到极显著水平。

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。根据回归方程，作出响应面和等高线，考察拟合响应曲面的形状，从中分析提取温度、液固比和提取时间对Monacolin K 得率的影响，结果见图6、7。

对于Y1模型:由图6 和表3 可以观察到，液固比和超声提取时间对应的酸型洛伐他汀Monacolin K 得率响应曲面为开口向下的凸形曲面，随着因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小。且只有BC 的P=0.0491＜0.05，所以说明液固比和超声提取时间之间有较强的交互作用，其余各因素间的交互作用不明显。

图6 提取温度和液固比(A)、提取温度和超声提取时间(B)及液固比和超声提取时间(C)对酸型Monacolin K 得率影响的等高线图和响应面Fig.6 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio(A)，extraction temperature and extraction time(B)，liquid/solid ratio and extraction time(C)on the extraction yield of acid form Monacolin K

图7 提取温度和液固比(A)、提取温度和超声提取时间(B)及液固比和超声提取时间(C)对内酯型Monacolin K 得率影响的等高线图和响应面Fig.7 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio(A)，extraction temperature and extraction time(B)，liquid/solid ratio and extraction time(C)on the extraction yield of lactone form Monacolin K

对于Y2模型:由图7 和表4 可以观察到，液固比和超声提取时间对应的内酯型洛伐他汀Monacolin K 得率响应曲面为开口向下的凸形曲面，随着因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小。且只有BC 的P=0.0255＜0.05，所以说明液固比和超声提取时间之间有较强的交互作用，其余各因素间的交互作用不明显。

3.2.2 青稞红曲中两种Monacolin K 提取工艺条件

通过软件中Optimization 的Numerical 功能，优化提取青稞红曲中Monacolin K 的理论最佳工艺为:提取温度为59.77 ℃，液固比为20.94∶1 mL/g，提取时间为64.70 min，酸式洛伐他汀Monacolin K 最大得率预测值为2.48134 mg/g，内酯型洛伐他汀Monacolin K 最大得率预测值为1.66217 mg/g。为检验RSA 法的可靠性，采用上述最优提取条件进行Monacolin K 提取试验。为操作便利，将最佳条件修正为提取温度为60 ℃，液固比为20∶1 mL/g，提取时间为60 min，实际测得青稞红曲中酸型Monacolin K得率2.51 mg/g，内酯型Monacolin K 得率1.65 mg/g。结果证明，Monacolin K 得率与理论预测值相当，故优化方案得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。

4 结论

响应面法克服了正交设计只能处理离散的水平值和不能给出直观图形，并无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷［6-9］。本文采用响应面法研究青稞红曲中Monacolin K 提取工艺参数，并通过响应面图直观分析了各因素及因素之间对青稞红曲中Monacolin K 得率的影响，优化提取青稞红曲中Monacolin K 的理论最佳工艺为:提取温度为59.77 ℃，液固比为20.94∶1 mL/g，提取时间为64.70 min。结合单因素实验对最佳工艺进行修正确定最佳提取条件:以纯甲醇为提取溶剂，提取时间为1 h，液固比20∶1 mL/g，提取温度60 ℃，得到青稞红曲中酸型Monacolin K 得率为2.51 mg/g，内酯型Monacolin K 得率为1.65 mg/g。此外，本文建立了HPLC 测定青稞红曲中两种Monacolin K 含量的方法，该方法克服了以往多数研究只测定红曲中Monacolin K 总量或只检测内酯型Monacolin K 含量，从而忽视二者比例的缺陷，不能较好体现青稞红曲的降脂价值［10-12］。通过本实验优化了青稞红曲中Monacolin K 提取工艺及含量测定方法，为青稞红曲中Monacolin K 的进一步研究提供理论基础。

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