板栗总苞总黄酮对三种不同肿瘤细胞的抑制作用

林思文，殷嫦嫦，殷 明，耿书国，汪建样，施剑明

1九江学院，九江 332000;2 南昌大学第二附属医院骨一科;3 南昌大学研究生院医学部，南昌 330006

黄酮是指两个带有酚羟基的苯环通过中央三碳原子连接而成的一类化合物，其已被证实能够有效地抑制多种肿瘤细胞生长［1-3］，并且，部分黄酮类化合物已开始被应用于临床治疗。板栗(Castanea mollissima)为壳斗科(Fagales)栗属(Castanea)植物，具有健脾养胃、益气补肾和止血强心的功用。板栗总苞，又称栗蓬，为包裹板栗坚果的带刺毛壳，板栗总苞总黄酮(total flavonoids from Castanea mollissima，CF)是利用超声提取技术从板栗总苞中提取的黄酮类物质的混合物［4］。MG-63、MCF-7 和SMMC-7721 分别是骨肉瘤、乳腺癌和肺癌的常见细胞系，本实验采用板栗总苞总黄酮作用于这三种不同的肿瘤细胞，探讨其抑制作用的强弱及其作用机制。

1 材料与试剂

1.1 细胞株

人骨肉瘤MG-63 细胞、人乳腺癌MCF-7 细胞、人肝癌SMMC-7721 细胞均为本实验室库存。

1.2 药物及试剂

板栗总苞总黄酮为九江学院药学院提供，纯度＞95%，用DMSO 配成400 mg/mL 的储存液于4 ℃备用;注射用吡柔比星(Pirarubicin，THP):浙江海正药业股份有限公司;DMSO、DMEM、琼脂糖、TAE、PBS 粉:北京索莱宝科技有限公司;四季青胎牛血清:杭州天杭生物科技有限公司;0.25%含EDTA 胰蛋白酶:美国Gibco 公司;Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒、GREENspin 组织/细胞RNA 提取试剂盒:北京庄盟国际生物基因科技有限公司;HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒:北京康为世纪生物科技有限公司;2 ×Taq Master Mix、DNA Marker:北京近岸科技有限公司;基因引物:南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

超净工作台:苏州净化设备有限公司;三气细胞培养箱:德国Eppendorf 公司;TS100-F 倒置荧光显微镜:日本Nikon 公司;酶标仪:美国BioTek 公司;凝胶成像系统:美国SIM 公司;冷冻高速离心机:珠海黑马医学仪器有限公司;PCR 仪:杭州博日科技有限公司;电泳仪:北京六一仪器厂。

2 实验方法

2.1 板栗总苞总黄酮对细胞形态的影响

分别同时培养人骨肉瘤MG-63 细胞、人乳腺癌MCF-7 细胞、人肝癌SMMC-7721 细胞，取对数生长期细胞消化后制成单细胞悬液，以5 ×104细胞/孔接种于24 孔板中，每孔加入1 mL 含10%的DMEM完全培养基。24 h 后细胞生长良好，更换等量含板栗总苞总黄酮的药物培养基。设置不同浓度梯度:50、100、200、400、800 μg/mL(均含0.2% DMSO)，各细胞组另设置一不含药物含0.2% DMSO 的阴性对照组和含浓度为2 μg/mL 吡柔比星的阳性对照组。在倒置相差显微镜下观察各细胞在不同药物浓度下不同时间段的形态。

2.2 板栗总苞总黄酮对细胞增殖的影响

取对数生长期MG-63、MCF-7、SMMC-7721 三种肿瘤细胞，按5 ×103细胞/孔接种于96 孔板中，每孔加入200 μL 完全培养基。待细胞贴壁良好后更换等量不同浓度(50、100、200、400、800 μg/mL)的含板栗总苞总黄酮的药物培养基，并设置含0.2%DMSO 的对照组，各浓度均设5个复孔和1个只含药物不含细胞的药物空白孔。分别在作用24 h 和48 h 后，各孔加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃孵育2 h后用酶标仪在450 nm 波长下测药物孔的吸光度A实验和药物空白孔吸光度A药空。计算各孔细胞的吸光度OD=A实验-A药空，并根据公式计算不同细胞在不同浓度下的增殖抑制率=(1-OD实验/OD对照)×100%，并通过软件进行回归分析计算其药物半数抑制浓度IC50。

2.3 板栗总苞总黄酮对细胞凋亡的影响

取对数生长期三种肿瘤细胞，按5 ×105细胞/孔接种于6 孔板中，每孔加入2 mL 完全培养基。待细胞生长良好处于对数生长期后，分别更换等量含200 μg/mL 板栗总苞总黄酮的药物培养基，并设置含0.2% DMSO 的完全培养基作为对照。作用48 h后，消化细胞并计数，按各组1 ×105细胞用PBS 漂洗2 遍后收集细胞，加入100 μL 1 ×Binding Buffer，再依次加入10 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染液，混匀后避光孵育15 min 后取少量液体滴加于载玻片，盖玻片压片后置于荧光显微镜下观察。

2.4 Bcl-2、Caspase-3、P21 mRNA 表达量检测

取对数生长期细胞接种于6 孔板中(5 ×105细胞/孔)，待细胞生长良好，分别更换等量含200 μg/mL 板栗总苞总黄酮的药物培养基，并设置含0.2%DMSO 的完全培养基的对照组。48 h 后按RNA 提取试剂盒说明提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明合成逆转录成cDNA，加入上下游引物按扩增说明进行目的基因的扩增。将扩增好的产物置于1%琼脂糖凝胶上电泳，用Image J 软件分析电泳后各条带的灰度。

2.5 统计学处理

3 实验结果

3.1 板栗总苞总黄酮对细胞形态的影响

板栗总苞总黄酮分别作用于MG-63、MCF-7、SMMC-7721 细胞，24 h 后部分细胞开始逐渐缩小变圆，内部颗粒增多，细胞边缘折光性增高，呈现细胞凋亡的形态改变;并随着时间的延长凋亡细胞逐渐增多，与各自对照组相比，细胞增殖明显受抑制。细胞凋亡及增殖抑制的变化在MG-63 细胞表现最明显，MCF-7 次之，SMMC-7721 变化最弱。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

3.2 板栗总苞总黄酮对细胞增殖的影响

板栗总苞总黄酮分别作用于MG-63、MCF-7、SMMC-7721 细胞，细胞增殖明显受抑制，分别与最低浓度组(50 μg/mL)相比，其抑制率均明显升高(P＜0.05)。这种抑制作用随着时间延长及浓度增加而升高，呈现明显的浓度及时间依赖性。通过EXCEL 软件计算，24 h 的药物半数抑制浓度为:IC50(MG-63)=305.58 μg/mL，IC50(MCF-7)=739.22 μg/mL，IC50(SMMC-7721)=4499.44 μg/mL。48 h的药物半数抑制浓度为:IC50(MG-63)=147.18 μg/mL，IC50(MCF-7)=254.42 μg/mL，IC50(SMMC-7721)=488.40 μg/mL。结果表明:板栗总苞总黄酮对细胞增殖抑制的作用在MG-63 细胞表现最明显、MCF-7 细胞次之，SMMC-7721 细胞最弱(如表2 所示)。

图1 药物作用48 h 后细胞形态学观察(×100)Fig.1 Morphologies of cell cultured with drugs for 48 h (×100)

表2 板栗总苞总黄酮对MG-63、MCF-7、SMMC-7721 细胞增殖的影响(n=5，)Table 2 Effect of CF on proliferation of MG-63，MCF-7，SMMC-7721 cells (n=5，)

表2 板栗总苞总黄酮对MG-63、MCF-7、SMMC-7721 细胞增殖的影响(n=5，)Table 2 Effect of CF on proliferation of MG-63，MCF-7，SMMC-7721 cells (n=5，)

注:与50 μg/mL MG-63 相比，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与50 μg/mL MCF-7 相比，#P＜0.05，##P＜0.01;与50 μg/mL SMMC-7721 相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:* P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 50 μg/mL MG-63;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 50 μg/mL MCF-7;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 50 μg/mL SMMC-7721.

图2 板栗总苞总黄酮对MG-63、MCF-7、SMMC-7721 作用48 h 后细胞凋亡荧光染色Fig.2 Apoptosis fluorescence staining of MG-63，MCF-7，SMMC-7721 cells cultured with CF for 48 h

3.3 板栗总苞总黄酮对细胞凋亡的影响

利用Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒检测凋亡细胞时，Annexin V-FITC 可染细胞膜，在荧光下呈绿色，PI 可染细胞膜，在荧光下呈红色。不染色者为正常细胞，只染Annexin V-FITC 者为早期凋亡细胞，只染PI 者为坏死细胞或细胞碎片，二者均染者为晚期凋亡细胞。如图2 所示，各细胞对照组凋亡细胞极少，实验组出现明显凋亡细胞，且以晚期凋亡为主。并且凋亡细胞数量呈现MG-63 ＞MCF-7 ＞SMMC-7721 趋势。

3.4 Bcl-2、Caspase-3、P21 mRNA 表达量检测

板栗总苞总黄酮能使三种不同肿瘤细胞Caspase-3、P21 mRNA 明显下调，使Bcl-2 mRNA 明显上调。比较各细胞实验组与对照组灰度值(grey level，G)的比值，偏离1 越远，说明上调或下调趋势越明显，如图3 结果显示:MG-63 细胞上调Caspase-3、P21 mRNA 及下调Bcl-2 mRNA 趋势最明显，MCF-7 细胞次之，SMMC-7721 细胞最弱。

图3 板栗总苞总黄酮对MG-63、MCF-7、SMMC-7721 作用48 h 后Bcl-2、Caspase-3、P21 mRNA 表达Fig.3 Expressions of Bcl-2，Caspase-3，P21 mRNA of MG-63，MCF-7，SMMC-7721 cells cultured with CF for 48 h

4 讨论

骨肉瘤、乳腺癌、肝癌是人体常见的三种原发性恶性肿瘤，其中骨肉瘤来源于间叶组织，乳腺癌和肝癌来源于上皮组织，其治疗原则大致相同:手术治疗术后辅之以化疗的综合治疗。相比传统化疗药物，中药应用于抗肿瘤，具有副作用小、不易产生耐药等优点。本实验采用板栗总苞总黄酮体外分别作用于人骨肉瘤MG-63 细胞、人乳腺癌MCF-7 细胞和人肝癌SMMC-7721 细胞三种不同组织来源的肿瘤细胞系，观察其对细胞增殖及凋亡的影响，CCK-8 及凋亡荧光染色结果提示:板栗总苞总黄酮具有明显的体外抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。RT-PCR 结果提示Bcl-2、Caspase-3、P21 基因可能参与了调控肿瘤细胞凋亡的过程。研究表明［5］，P21 能调节肿瘤细胞对化疗和放疗等外界刺激的反应。例如，构建针对P21 shRNA 的干扰载体发现，P21 mRNA 的低表达可以减少姜黄素诱导的人肝癌Huh7 细胞的凋亡，说明这种细胞凋亡可能涉及P21 凋亡信号途径。此外，有研究已经证实［6］，随着肿瘤恶性程度的的增加，P21 mRNA 及其蛋白的表达有减少的趋势。因此，P21 是一个具有多个功能的肿瘤抑制基因，其通过复杂的机制发生效应。Caspase-3 和Bcl-2 是细胞凋亡的标记性基因，Caspase-3 的激活能引起某些底物如PARP 的断裂，继而导致细胞凋亡［7］，另有观点［8］认为，Caspase-3 作为细胞色素C 的下游的靶基因，是线粒体-细胞色素C 凋亡途径的一个关键步骤;bcl-2 蛋白的表达水平与线粒体内稳态的平衡密切相关，可能是通过某些抗氧化剂抑制线粒体内膜氧自由基的产生而达到抑制细胞凋亡的目的［9，10］。研究发现［10］，P21 的高表达能够激活由顺铂引起的骨肉瘤O2OS 细胞凋亡所致的Casapae-3 和Bax/Bcl-2 级联反应。可见P21 基因的高表达既能直接诱导细胞凋亡，又能间接地通过调控Casapae-3 和Bcl-2 的表达诱导细胞凋亡。

综上所述，板栗总苞总黄酮体外能明显抑制MG-63、MCF-7 和SMMC-7721 细胞增殖，并通过调控Bcl-2、Caspase-3、P21 基因的表达而诱导肿瘤细胞凋亡，其作用强度为:MG-63 ＞MCF-7 ＞SMMC-7721。

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5 Wang WZ(王伟章)，Zhang BY(张碧鱼)，Mei WJ(梅文杰)，et al.Effect of p21-targeted shRNA on curcumin-induced apoptosis of human hepatoma Huh7 cells.Acta Pharm Sin(药学学报)，2009，44:1102-1106.

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7 Norbury CJ，Zhivotovsky B.DNA damage-induced apoptosis.Oncogene，2004，23:2797-808.

8 Lin TK，Cheng CH，Chen SD，et al.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress promote apoptotic cell death in the striatum via cytochromec/caspase-3 signaling cascade following chronic rotenone intoxication in rats.Int J Mol Sci，2012，13:8722-8739.

9 Gogvadze V，Orrenius S.Mitochondrial regulation of apoptotic cell death.Chem-Biol Interact，2006，163(1-2):4-14.

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