沉淀聚合法制备1-脱氧野尻霉素分子印迹聚合物微球及其性能研究

罗孟君，邓凤君，郭巧红，陈宗高，陈 波

1益阳医学高等专科学校，益阳 413000;2 益阳市第一中学，益阳 413000;3 湖南师范大学化学化工学院，长沙 410081

分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术，常常被形容为制造识别“分子钥匙”的人工“锁”技术。分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)是一类通过分子印迹技术合成的对特定目标分子(模板分子)及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物。由于其能够特异性识别印迹分子，因此近年来被广泛应用于色谱分离［1］、膜分离［2］、固相萃取［3］、药物控制释放［4］、化学传感［5］、环境检测［6］等领域。

1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)又名1-去氧野艽霉素，是一种哌啶类多羟基生物碱，化学名称(2R，3R，4R，5S)-2-羟甲基哌啶-3，4，5-三醇，通常为白色粉末，分子式为C6H13NO4，其结构式如图1。

图1 1-脱氧野尻霉素结构式Fig.1 Chemical structure of DNJ

DNJ 是目前糖尿病治疗药物中唯一国际公认的零伤害生物制剂，具有对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，是降血糖、治疗糖尿病的有效成分［7，8］，此外还具有抗病毒［9，10］、抗肿瘤转移［11］等药理作用。近年来，国内外学者对DNJ 的来源、在生物体内的合成机制及化学合成方法进行了大量的研究探索，希望为找到一种稳定、高效、经济的获取DNJ 的途径提供理论基础。

本研究以DNJ 为模板分子，MAA 为功能单体，EGDMA 为交联剂，2，2'-偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，乙腈为致孔剂，采用沉淀聚合法合成了对DNJ分子有特异性吸附、识别性能的MIP 微球，用于DNJ的选择性吸附和富集。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1-脱氧野尻霉素标准品(批号:024K4076，美国Sigma 公司);甲基丙烯酸(MAA，99%，美国Sigma公司);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%，科密欧);偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯，阿拉丁试剂有限公司);乙腈(色谱纯，科密欧)

恒温水浴锅(HH-4，巩义市予华仪器有限责任公司);Agilent 1100 系列高效液相色谱仪，含FLD荧光检测器;扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S-4300，日本日立公司);电子天平(AX-200，日本Shimadzu Philippines 公司)

1.2 分子印迹聚合物微球的制备

1.2.1 溶剂的考察

准确称取0.25 mmol 的DNJ，分别溶于氯仿、乙腈、四氢呋喃、甲醇四种溶剂中，对其溶解能力进行观察。

1.2.2 反应时间的考察

在固定其他反应条件不变的前提下，采用不同的反应时间合成了1-脱氧野尻MIP 微球。通过对产率进行考察，从而确定最佳的反应时间。

1.2.3 DNJ 分子印迹聚合物微球的制备

称取DNJ 溶于一定量乙腈中，加入功能单体MAA，于室温下震荡30 min，置于冰箱中过夜，使DNJ 与MAA 充分作用，然后加入交联剂EGDMA 和引发剂AIBN，充分混匀后，向混合液中通氮气10 min 除氧后密封，将混合液置于恒温水浴箱，60 ℃热聚合聚合24 h。聚合产物取出冷却至室温，离心获得聚合物沉淀，用V(甲醇)∶V (乙酸)=9∶1 溶液洗掉模板分子和未聚合的功能单体和交联剂，直至洗脱液中检测不到模板分子，再用甲醇洗去过量的乙酸，于烘箱中40 ℃真空干燥。所得聚合物为MIP;同时按同样方法不加DNJ 制备空白聚合物(NIP)。

1.3 吸附性能测定

1.3.1 标准曲线的绘制

准确称取100.0 mg DNJ 标准品，用乙腈定容至10 mL 容量瓶，得到10 mg/mL 的DNJ 标准溶液母液，然后根据母液配制1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 μg/mL 的梯度标准溶液，按照文献［14］所述柱前衍生-高效液相色谱法，用高效液相色谱-荧光检测器测定，测得DNJ 峰面积A，绘制DNJ 溶液浓度与色谱峰面积值的工作曲线，并进行线性回归处理。

衍生化处理条件为:取10 μL DNJ 对照品溶液，依次加入10 μL 0.4 mol/L K3BO3缓冲液(pH 8.5)、20 μL 5 mmol/L FMOC-Cl 乙腈溶液，混匀后于20 ℃下反应20 min，加入10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸水溶液以中止反应，反应液再加入到950 μL 0.1%醋酸中，经0.45 μm 微孔滤膜滤过后进行色谱分析。

色谱条件为:色谱柱为Inertsil ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈:0.1%醋酸水溶液(50∶50，V/V)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，荧光检测器激发波长为254 nm，吸收波长322 nm，进样量15 μL。

1.3.2 聚合物吸附性能的测定

将100.0 mg 1-脱氧野尻霉素MIP 微球放入40 mL 磨口锥形瓶中，分别加入不同浓度的DNJ 乙腈溶液，室温振荡吸附24 h，离心分离后，取上层清液，用柱前衍生-高效液相色谱法测定DNJ 浓度，平行三次取平均值，根据吸附前后浓度变化计算聚合物的吸附量Q(mg/g);绘制出吸附量Q 与不同浓度关系的静态等温吸附曲线。同时考察NIP 微球的吸附性能。

其中:Co:吸附前溶液中DNJ 的浓度(mg/mL);Ce:吸附后溶液中DNJ 的浓度(mg/mL);m:称取的分子印迹聚合物的质量(mg);V:DNJ 溶液的体积(mL)。

1.3.3 吸附动力学测定

根据聚合物吸附性能测定结果，分别称取100 mg MIP 和NIP 微球至50 mL 磨口锥形瓶中，分别加入25 mL 浓度为0.5 mg/mLDNJ 乙腈溶液，然后将其放入恒温振荡器中室温振荡。每隔20 min 取20 μL 溶液进行色谱分析，测定溶液中DNJ 浓度，从而分析其吸附动力学性质。

1.4 MIP 微球的选择性考察

为了考察MIP 微球的选择性识别性能，选用1-脱氧野尻霉素的结构类似物N-甲基-1-脱氧野尻霉素作为竞争底物，在浓度为5.0 mmol/L 的乙腈溶液中进行平衡吸附实验，测定达到平衡时溶液中的目标分子浓度，并计算出分离系数(KD)及1-脱氧野尻霉素与N-甲基-1-脱氧野尻霉素的分离因子(α)，其中，KD=cp/cs，cp(mmol/g)表示聚合物结合底物的浓度，cs(mmol/L)表示溶液中底物的平衡浓度，α为2 种不同底物的分离系数之比。

1.5 聚合物微球扫描电镜分析

利用Hitachi S-4300 SEM 对聚合物微球的表面结构和粒径进行分析。

2 结果与讨论

2.1 DNJ 分子印迹聚合物的制备

2.1.1 溶剂的选择

统一溶剂量为20 mL，溶解模板分子，实验结果如表1 所示，只有乙腈和甲醇能够溶解模板分子，结合印迹分子与功能单体之间的疏水作用，应选择致孔效果较好的溶剂作为致孔剂，综合考虑使用乙腈作为溶剂更合适。

表1 1-脱氧野尻霉素溶解性实验Table 1 DNJ solubility experiment

2.1.2 聚合时间的考察

在固定其他反应条件不变的前提下，通过考察聚合产物产率随时间的变化关系，对产率作图得到图2，由图可知，聚合物产率随时间增长而增大，当时间为24 h 时，得率为85.4%，此后时间增大，产率随之增大的幅度已经很小，因此，本实验以24 h 的聚合时间为最佳。

图2 时间对聚合物产率的影响Fig.2 The influence of reaction time on polymerization rate

2.2 MIP 与NIP 对DNJ 吸附性能的考察

2.2.1 标准曲线

以色谱峰面积A 对标准溶液浓度C 进行线性回归，得回归方程:A=317974C +9983，相关系数R=0.9982，结果表明在1～10 μg/mL 之间，线性关系良好。

2.2.2 吸附量的考察

分别考察了MIP 与NIP 对不同浓度DNJ 溶液的吸附性能，绘制出了相应的等温吸附曲线，吸附详情见图3。由图可知，在0.1～0.8 mg/mL 范围内，吸附量与溶液浓度成正相关性，当浓度达到一定程度，吸附量不再升高，达到饱和。而印迹聚合物的吸附量明显大于非印迹聚合物，这是由于印迹聚合物中有预定的孔穴，孔穴中有特定排列的功能基能够与模板分子产生作用，而非印迹聚合物中则没有这种孔穴。

图3 MIP 与NIP 对DNJ 分子的等温吸附曲线Fig.3 Adsorption isotherm of theophylline MIP and NMIP

2.2.3 MIP 与NIP 微球的吸附动力学

对MIP 与NIP 微球进行吸附动力学测定，结果如图4。

图4 MIP 与NIP 吸附动力学Fig.4 Kinetics of adsorption of MIP and NIP

由图4 可知，随着时间增长，MIP 对DNJ 的吸附量逐渐增大，当吸附时间达到100 min，吸附接近饱和。NIP 对DNJ 吸附量不大，随时间增长，也呈增大的趋势。

2.3 MIP 微球对底物的吸附选择性考察

本实验以与1-脱氧野尻霉素结构类似的N-甲基-1-脱氧野尻霉素作为竞争底物，在浓度为5.0 mmol/L 的乙腈溶液中进行平衡吸附实验。实验结果如表2 所示:

表2 MIP 微球的选择性Table 2 Selectivity of MIP microspheres

由表2 可知，与NIP 微球相比，MIP 微球对DNJ具有较好的选择性。

2.4 MIP 与NIP 扫描电镜分析

用扫描电子显微镜(SEM)分别观测两种微球的形貌，扫描结果如图5 所示:

图5 MIP(左)与NIP(右)扫描电镜图Fig.5 The SEM photographs of MIP and NIP

由图5 可以看出，实验中制备的MIP 与NIP 形态均一，除NIP 粒径较MIP 大外，彼此间无明显差异，这可能是由于模板分子DNJ 的存在，使得聚合物生成过程中其分子内部结构形成固定形状的孔穴，从而空间排列发生了改变。

3 结论

本文采用沉淀聚合法制备了1-脱氧野尻霉素分子印迹聚合物微球，并对其制备方法进行了初步优化。吸附性能考察实验说明，印记聚合物对DNJ分子能选择性吸附，MIP 吸附性能较NIP 强。吸附选择性实验结果表明，相对于与DNJ 结构相似的N-甲基-1-脱氧野尻霉素，本实验所制备的MIP 微球对DNJ 有较强的选择结合特性。该方法简单易行，聚合物微球颗粒在1 μm 左右，为开发天然产物中1-脱氧野尻霉素的分离提纯新工艺提供了理论基础。

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