深海来源真菌Penicillium sp.F00120 代谢产物的研究

田永奇 ，林秀萍 ，刘 娟，王俊峰，杨 斌，鞠志冉，陶华明，刘永宏

1中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室，广州 510301;2中国科学院大学，北京 100049;南方医科大学中医药学院，广州 510515

经过60 多年的不懈努力，海洋天然产物研究已经有了长足的进步，药学家们不断地从海洋生物中分离出结构新颖，活性良好的化合物，超过0.1%的化合物已作为新药的先导化合物。镇痛药物Ziconotide、抗肿瘤药物ET-743 和抗肿瘤药物HaLichondrin B 等海洋药物的相继上市标志着海洋天然产物在新药研发中占据了重要的位置［1］。海洋微生物与海绵、珊瑚并列成为海洋天然产物的三大来源［2］。由于海洋真菌具有次级代谢产物丰富、活性多样和易于发酵培养等优点，成为发现新的海洋活性天然产物的宝库。迄今为止，已经从海洋真菌的发酵产物中发现了1000 多个新化合物。这些代谢产物都表现出良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒和神经心血管等活性［3］。

深海的高压、低温等极端环境赋予了深海真菌独特的个性。深海真菌的次级代谢产物以结构新颖，活性良好著称，目前已经成为药学家们关注的热点。2012年，本学科组从深海沉积物来源的真菌Penicillium sp.F00120 中分离得到了一个结构新颖的倍半萜醌类化合物penicilliumin A［4］。该化合物具有抗肿瘤活性，是迄今为止报道的少数几个来源于微生物的倍半萜醌类化合物之一。本文作为此工作的延续，采用高盐培养基进行发酵，从Penicillium sp.F00120 的发酵产物中分离得到了9 个化合物，通过核磁共振、文献对照等方法鉴定了这些化合物的结构，其中化合物6 和7 为penicilliumin A 的同系物。

1 仪器与材料

核磁共振波谱仪:Brucker Avance DRX500 型(500/125 MHz，TMS 为内标)。HR-ESI-MS:Bruker micro TOF-QII mass spectrometer(Bruker，Fällanden，Switzerland)。EYELAN-1000 型旋转蒸发仪。高效液相色谱仪:Agilent 1200(泵型号:G1212C，紫外检测器型号:G1315D)，YMC-Pack(C8 250 × 10 mm I.D.S-5 μm，12 nm)。TLC:高效薄层层析板(HPTLC)为德国Merck 公司产品和烟台江友硅胶开发有限公司产品。显色剂:10%硫酸香兰素溶液。常用有机试剂均为国产的分析纯产品。

海洋真菌菌株F00120 从采自中国南海北部(Lat.22°6.017'N，Long119°17.440'E)1300 m 的海底沉积物样品分离得到，经形态特征和分子生物学鉴定，确定其属于青霉属，并命名为Penicillium sp.F00120［4］。该菌株现保存于中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室。

2 真菌发酵

将保藏于4 ℃斜面的Penicillium sp.F00120 接种到MB 固体培养基(麦芽浸膏1.5 g，粗海盐1 g，琼脂粉1.5 g，蒸馏水100 mL，pH 7.4～7.8)平板上，于25 ℃培养箱中培养7 d。将活化后的菌株转接到装有10 mL MB 液体培养基(麦芽浸膏1.5 g，粗海盐1 g，蒸馏水100 mL，pH 7.4～7.8，加玻璃珠)的100 mL 三角瓶中，于28 ℃、180 rpm 摇床培养2 d。将10 mL 种子培养液转接入装有大米固体培养基(大米200 g，粗海盐6 g，自来水200 mL)的1000 mL 三角瓶中，于25 ℃静置培养60 d，共发酵培养30 瓶。

3 提取与分离

Penicillium sp.F00120 的固体发酵物用丙酮浸泡过夜，搅拌粉碎，超声提取15 min。提取物抽滤，蒸去丙酮，水层浓缩体积，用乙酸乙酯萃取2 次，收集上清液。固体残渣再用乙酸乙酯浸提3 次，每次浸泡过夜，抽滤，收集上清液。将5 次得到的上清液合并，减压旋转蒸发，共得浸膏47.6 g。粗浸膏以1∶1 的比例与100～200 的硅胶H 拌匀，待干燥后填入中压正相硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，TLC 薄层检测后合并，得到8 个馏分Fra.1～8。Frs.4 经重结晶得到化合物1 (200 mg);Frs.5 经液相制备(CH3OH∶H2O=6∶4)得到化合物2(25 mg);Fra.7 经Sephadex LH-20 凝胶柱(甲醇)分离，得到5 个馏分Fra.7a～Frs.7e，其中Fra.7c 经正相硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)洗脱，得到8 个馏分Fra.7c1～Fra.7c8。Fra.7c3 重结晶得到化合物3(27 mg)。Fra.7c5 经正相硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇(1 ∶0～0 ∶1)，得到化合物4(3 mg)、5(15 mg)。Fra.7d 经ODS 柱分离，甲醇-水(1∶9，1 ∶1，7 ∶3，9 ∶1)得到4 个馏分Fra.7d1～ Fra.7d4。Fra.7d3 经液相制备(CH3OH∶H2O=6∶4)得到化合物6(5.3 mg)、7(4.7 mg)、8(10 mg)、9(20 mg)。

4 结构鉴定

化合物1 白色针状结晶(CH3OH)，254 nm 处有紫外吸收。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.59(1H，brm，H-6)，5.39 (1H，brm，H-7)，5.22 (2H，m，H-22，23)，3.67 (1H，m，H-3)，1.04 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-21)，0.97 (3H，s，H3-10)，0.93 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-28)，0.83 (6H，t，J=7.5 Hz，H3-26，H3-27)，0.65 (3H，s，H3-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δc::141.4 (C，C-8)，139.8 (C，C-5)，135.6(CH，C-21)，132.0 (CH，C-22)，119.6 (CH，C-6)，116.3 (CH，C-7)，70.5 (CH，C-3)，55.8 (CH，C-17)，54.6 (CH，C-14)，46.3 (CH，C-9)，42.8 (CH，C-13)，40.8 (CH2，C-4)，40.4 (CH，C-24)，39.1(CH2，C-12)，38.4 (CH2，C-1)，37.1 (C，C-10)，33.1 (CH，C-25)，32.0 (CH2，C-2)，28.3 (CH2，C-16)，23.0 (CH2，C-15)，21.1 (CH3，C-21)，19.9(CH3，C-26)，19.6 (CH3，C-27)，17.6 (CH3，C-28)，16.3 (CH3，C-19)，12.1 (CH3，C-18)。以上数据与文献［5］对照，基本一致，确定化合物结构为ergosterol。

化合物2 淡黄色油状物，254 nm 处有紫外吸收。EI-MS:112［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:5.73 (1H，m，H-3)，4.34 (2H，t，J=10 Hz，H2-6)，2.41 (2H，t，J=5 Hz，H2-5)，1.99 (3H，brs，H3-7);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δC:167.33 (C=O，C-2)，162.10 (C，C-4)，116.63 (CH，C-3)，67.63(CH2，C-6)，30.32 (CH2，C-5)，23.11 (CH3，C-7)。以上数据与文献［6］对照，基本一致，确定化合物结构为4-methyl-5，6-dihydro-2-pyranone。

化合物3 白色晶体，EI-MS:500 ［M］+，高分辨给出分子式为C28H36O8;1H NMR (500 MHz，DMSO)δH:5.24 (1H，s，H-11)，4.77 (1H，d，J=4.5 Hz，H-6)，4.48 (1H，brs，H-3)，3.89 (1H，d，J=14.3，4.5 Hz，H-7β)，3.40 (3H，s，H3-28)，2.48(1H，m，H-9)，2.33 (1H，dd，J=14.3，4.5 Hz，H-7α)，1.99 (3H，s，H3-27)，1.90 (1H，brs，H-1)，1.88 (1H，brs，H-5)，1.74 (3H，s，H3-21)，1.57(1H，m，H-2)，1.28 (3H，s，H3-18)，1.12 (3H，s，H3-22)，1.02 (3H，s，H3-20)，0.89 (3H，s，H3-24)，0.78 (3H，s，H3-25);13C NMR (DMSO，125 MHz)δc:194.3 (C，C-15)，194.1 (C，C-17)，179.2 (C，C-23)，173.2 (C=O，C-19)，169.6 (C=O，C-26)，140.3 (C，C-12)，118.4 (CH，C-11)，103.5 (C，C-16)，77.9 (CH，C-6)，75.5 (CH，C-3)，70.0 (C，C-14)，54.8 (C，C-13)，53.8 (CH，C-5)，50.6 (CH，C-9)，50.2 (CH3，C-28)，43.2 (C，C-10)，41.1 (C，C-8)，36.4 (CH2，C-7)，33.8 (C，C-4)，25.8 (C，C-24)，24.2 (CH3，C-22)，22.0 (C，C-25)，21.7 (CH，C-2)，20.9 (CH3，C-21)，20.7 (CH3，C-27)，20.6(CH，C-1)，17.7 (CH3，C-20)，7.9 (CH3，C-18)。以上数据与文献［7］对照，基本一致，确定化合物结构为citreohybridonol。

化合物4 白色晶体，EI-MS:428 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.27 (2H，m，H-22，H-23)，4.88 (1H，brd，J=6.6 Hz，H-7α)，4.31 (1H，m，H-3α)，3.37 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6β)，2.55(1H，dd，J=13.2，11.7 Hz，H-4β)，1.28 (3H，s，H3-19)，1.07 (3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，0.96 (3H，s，H3-18)，0.94 (3H，d，J=6.9 Hz，H3-28)，0.85 (6H，d，J=6，8 Hz，H3-26，H3-27);13C NMR (150 MHz，CDCl3)δc:151.6 (C-14)，135.2 (C-22)，132.4(C-23)，126.8 (C-8)，68.7 (C-3)，64.9 (C-5)，63.6(C-7)，60.3 (C-6)，55.4 (C-17)，43.7(C-13)，42.9(C-24)，40.5 (C-20)，39.3 (C-9)，39.2 (C-4)，37.1 (C-12)，34.9 (C-10)，33.1 (C-25)，33.0 (C-1)，31.2 (C-2)，28.0 (C-16)，25.9 (C-15)，21.1(C-21)，20.0 (C-27)，19.7 (C-26)，19.3 (C-11)，17.9 (C-28)，17.7 (C-28)，16.9 (C-19)。以上数据与文献［8］对照，基本一致，确定化合物结构为5α，6α-Epoxy-(22E，24R)-ergosta-8(14)，22-diene--3β，7β-diol。

化合物5 无色油状物，EI-MS:354 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:5.36 (4H，m，H-9，10，12，13)，4.20 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，Ha-19)，4.16 (1H，dd，J=11.5，6 Hz，Hb-19)，3.93 (1H，m，H-20)，3.70 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-21a)，3.60 (1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-21b)，2.77 (2H，t，J=6.5 Hz，H2-11)，2.35 (2H，t，J=7.5 Hz，H2-2)，2.05 (4H，m，H2-8，H2-14)，1.64 (2H，m，H2-3)，1.25～1.40 (14H，m)，0.89 (3H，t，J=6.5 Hz，H3-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:174.3 (C=O，C-1)，130.2 (CH，C-9)，130.0 (CH，C-13)，128.1(CH，C-10)，127.9 (CH，C-9)，70.3 (CH，C-20)，65.2 (CH2，C-19)，63.3 (CH，C-21)，34.1 (CH2，C-2)，31.5 (CH2，C-16)，29.6 (CH2，C-7)，29.3(CH2，C-6)，29.1 (CH2，C-17)，29.1 (CH2，C-5)，29.1 (CH2，C-4)，27.2 (CH2，C-8)，27.2 (CH2，C-14)，25.6 (CH2，C-11)，24.9 (CH2，C-3)，22.6(CH2，C-17)，14.1 (CH3，C-18)。以上数据与文献［9］对照，基本一致，确定化合物结构为1-Linoleoylglycerol。

化合物6 白色固体，EI-MS:360 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:5.91 (1H，d，J=1.6，H-2')，4.77 (1H，brs，Ha-12)，4.52 (2H，brs，Hb-12 and H-4')，4.29 (1H，d，J=17.7 Hz，H-7'a)，4.21(1H，d，J=17.7 Hz，H-7'b)，3.67 (1H，d，J=2.9 Hz，H-5')，2.33 (1H，ddd，J=12.6，3.9，2.5 Hz，H-7e)，2.31 (1H，d，J=14.0 Hz，H-11a)，1.92 (1H，td，J=12.6，3.9 Hz，H-7a)，1.81 (1H，dd，J=14.0，11.1 Hz，Hb-11)，1.76 (1H，dt，J=12.6，3.9 Hz，H-1e)，1.75 (1H，d，J=11.1 Hz，H-9)，1.72 (1H，m，H-6e)，1.60 (1H，qt，J=13.6，3.4 Hz，H-2a)，1.49(1H，dquint，J=13.6，3.4 Hz，H-2e)，1.38 (1H，dm，J=13.6 Hz，H-3e)，1.30 (1H，qd，J=12.6，3.9 Hz，H-6a)，1.21 (1H，td，J=13.6，4.6 Hz，H-3a)，1.18 (1H，td，J=13.6，3.4 Hz，H-1a)，1.12 (1H，dd，J=12.6，2.5 Hz，H-5)，0.70 (3H，s，H3-13)，0.79 (3H，s，H3-14)，0.85 (3H，s，H3-15);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC:195.4 (C=O，C-1')，161.2(C，C-3')，150.5 (C，C-8)，120.2 (CH，C-2')，107.4 (CH2，C-12)，64.3 (CH，C-4')，64.0 (CH2，C-7')，62.2 (CH，C-5')，59.5 (C，C-6')，55.7 (CH，C-5)，51.5 (CH，C-9)，43.3 (CH2，C-3)，40.7 (C，C-10)，40.0 (CH2，C-1)，39.3 (CH2，C-7)，34.5(C，C-4)，34.1 (CH3，C-13)，25.6 (CH2，C-6)，22.2(CH3，C-14)，22.0 (CH2，C-11)，20.4 (CH2，C-2)，15.0 (CH3，C-15)。以上数据与文献［10］对照，基本一致，确定化合物结构为Macrophorin。

化合物7 无定型粉末，EI-MS:418 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)，δH:6.12 (2H，brs，H2-2')，4.90 (1H，brs，H-12a)，4.79 (1H，brs，H-12b)，4.41 (2H，brs，H-7')，3.96 (1H，s，H-5')，3.05(1H，d，J=17.2 Hz，H-8'e)，2.91 (1H，d，J=17.2 Hz，H-8')，2.36 (1H，ddd，J=12.9，3.9，2.5 Hz，H-7b)，2.20 (1H，dd，J=14.8，4.6 Hz，H-11a)，2.11 (1H，td，J=12.9，4.8 Hz，H-7a)，1.97 (1H，m，H-11b)，1.82 (1H，m，H-9)，1.73 (1H，brd，J=12.9 Hz，H-6b)，1.72 (1H，brd，J=13.7 Hz，H-1b)，1.58 (1H，qt，J=13.7，3.4 Hz，H-2a)，1.45 (1H，qt，J=13.7，3.4 Hz，H-2b)，1.36 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-3b)，1.31 (1H，qd，J=12.9，3.9 Hz，H-6a)，1.17 (1H，dd，J=12.5，2.5 Hz，H-5)，1.14 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-3a)，1.12 (1H，td，J=13.7，3.4 Hz，H-1a)，0.84 (3H，s，H3-13)，0.78 (3H，s，H3-14)，0.70 (3H，s，H3-15);13C NMR (125 MHz，CD3OD)δc:192.3 (C=O，C-1')，167.8 (C=O，C-9')，164.5 (C，C-3')，150.1 (C，C-8)，120.4 (CH2，C-2')，108.0 (CH2，C-12)，85.2 (C，C-6')，74.7(CH，C-5')，71.8 (C，C-4')，60.7 (CH2，C-7')，56.2 (CH，C-5)，50.2 (C，C-9)，43.3 (CH2，C-8')，42.8 (CH2，C-3)，41.0 (C，C-10)，39.3 (CH2，C-1)，38.8 (CH2，C-7)，34.2 (C，C-4)，33.8 (CH3，C-13)，25.2 (CH2，C-6)，22.2 (CH2，C-11)，22.0(CH3，C-14)，19.9 (CH2，C-2)，15.1 (CH3，C-15)。以上数据与文献［11］对照，基本一致，确定化合物结构为purpurogemutantin。

化合物8 黄色粉末，EI-MS:218 ［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.37 (1H，s，H-4)，6.31 (2H，s，H-5，7)，4.22 (1H，m，H-2')，4.02(1H，m，H-4')，2.62 (1H，dd，J=14.4，4.9 Hz，Hb-1')，2.55 (1H，dd，J=14.4，8.Hz，Ha-1')，1.58(1H，ddd，J=14.2，8.2，7.2 Hz，Ha-3')，1.33(1H，ddd，J=14.2，4.9，3.9 Hz，Hb-3')，1.19 (3H，d，J=6.3 Hz，CH3-5');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:167.9 (C=O，C-1)，167.3 (C，C-6)，164.9 (C，C-8)，156.2 (C，C-3)，141.3 (C，C-10)，107.2 (CH，C-4)，103.7 (CH，C-5)，102.7 (CH，C-7)，99.9 (C，C-9)，67.1 (CH，C-2')，65.3 (CH，C-4')，47.0 (CH2，C-3')，43.0 (CH2，C-1')，24.4(CH3，C-5')。以上数据与文献［12］对照，基本一致，确定化合物结构为3-(2S，4S-dihydroxypentyl)-6，8-dihydroxyisocoumarin。

化合物 9 无色针状结晶，EI-MS:280［M］+;1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.56 (1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.53 (1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.96 (1H，s，H-2)，4.10 (1H，m，H-2')，2.62(1H，dd，J=14.4，5.1 Hz，H-1')，2.62 (3H，s，H3-11)，2.55 (1H，dd，J=14.4，7.9 Hz，H-1')，1.18(1H，d，J=6.2 Hz，H-3');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:182.11 (C，C-4)，167.2 (C，C-5)，163.1 (C，C-9)，161.6 (C，C-2)，143.8 (C，C-7)，118.1 (CH，C-3)，118.1 (C，C-3)，116.0 (C，C-10)，112.6 (CH，C-6)，101.8 (CH，C-8)，66.5(CH，C-2')，44.3 (CH2，C-1')，23.6 (CH3，C-11)，23.2 (CH3，C-3')。以上数据与文献［13］对照，基本一致，确定化合物结构为 5-hydroxy-7-(2'-hydroxypropyl)-2-methyl-chromone。

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