黑果枸杞对X 射线辐射小鼠的保护作用研究

段雅彬，姚星辰，王 财，陈湘宏，张娟玲，李向阳*

1青海大学医学院;2 青海大学附属医院，青海 西宁 810001

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)茄科枸杞属，是西北地区特有的一种多棘刺灌木，主要产于青海柴达木盆地，其中含有大量的原花青素、花青素、多糖、维生素等营养成分。具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、清除自由基等作用［1，2］。黑枸杞藏药名“旁玛”，藏医用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等［3］。

辐射已是当今社会不容忽视的问题，化疗病人人数逐年增加，高原恶劣的强紫外线环境，以及近年的核泄漏事件都成为威胁人类健康的重要因素。氨磷汀作为世界公认的抗辐射药物能明显保护机体组织，但引起血压降低，恶心，呕吐等症状使得其使用受限。目前对于黑枸杞的研究主要集中在成分提取与分析上，而其抗辐射作用未见报道。本研究通过黑枸杞对辐射小鼠的抗氧化系统、血液系统、DNA、细胞凋亡通路的保护阐明其抗辐射作用，为黑果枸杞的临床开发提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 实验药物

1.2 主要试剂

超氧化物岐化酶(SOD，批号:20140414);丙二醛(MDA，批号:20140412);谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX，批号:20140416);总抗氧力(T-AOC，批号:20140416);过 氧 化 氢 酶(CAT，批 号:20140417);总蛋白定量BCA 法(批号:20140508)均购自南京建成生物研究所。小鼠半胱氨酸蛋白酶3酶联免疫检测试剂盒(caspase3，批号:20141227.60325M);小鼠半胱氨酸蛋白酶6 酶联免疫检测试剂盒(caspase6，批号:20141227.60328M)均购自北京瑞格博科技发展有限公司。血液细胞分析仪用溶血剂(批号:2013111101);三分类探头清洁液(批号:2013112101);血液细胞分析仪用稀释液(批号:2013110701)均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.3 主要仪器

医用电子直线加速器(美国VaRian，23EX)，UV-2550 型紫外分光光度计(美国LabTech 公司)，TGL-16 B 型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，KA-1000 型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，RE-52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHZ-IIID 型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)，DK-2000-ⅢL 型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，KQ-250DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，RT-2100C 酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)，DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，DRT-2N型电热套(郑州大城科工贸有限公司)，YDS-30 东亚液氮容器(乐山市东亚机电工贸有限公司)，BT224S 电子天平［赛多利斯科学仪器(北京)有限公司］，XW-80A 漩涡混合器(上海医大仪器厂)，BC-2300 准全自动三分群血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

1.4 动物

8 周龄SPF 级昆明种小鼠，雌雄各半，体重(25±2)g，购自甘肃中医学院，合格证号:SCXK(甘)2011-0001。分笼饲养于青海大学医学院实验动物中心。饲养条件:光照明暗12 h 交替;自由饮水;温度:(23 ±2)℃;适应性喂养3 d;每笼10 只群养。

2 实验方法

2.1 样品制备

采用浸渍法，溶剂为水，时间4 h，液料比为1/20，温度70 ℃。分别称取黑枸杞及枸杞300 g，6000 mL 蒸馏水，70 ℃恒温水浴锅，避光浸泡4 h。旋转蒸发仪70 ℃回收溶剂，过滤，定容到750 mL(终浓度为400 mg/mL)，4 ℃避光保存备用。

2.2 动物分组

取小鼠90 只，随机分为6 组:正常对照组(Normal control)、阳性对照组(Positive)(氨磷汀，150 mg/kg)、辐射模型组(Model)、黑果枸杞高剂量(L.ruthenicum high dose group，LH)(8 g/kg)、中剂量(L.ruthenicum middle dose group，LM)(4 g/kg)、低剂量(L.ruthenicum lower dose group，LL)(2 g/kg)组，雌雄各半。

2.3 给药方法

给药组每日灌胃给药，空白对照组、辐射模型组灌胃等容积生理盐水，剂量为0.2 mL/10g，连续14 d;阳性组于照射前30 min 腹腔注射剂量为150 mg/kg 的氨磷汀溶液。

2.4 辐射条件

将每只小鼠单独固定在自制模具中，采用美国VaRian 23EX 医用电子直线加速器X-Rays 全身一次性照射，照射剂量5 Gy，吸收剂量率300 cGy/min，照射时间:100 s，视野40 ×40 cm，源皮距100 cm。

2.5 外周血象检测

在照射后第7 d，摘眼球取血于含有EDTA-2Na抗凝管中制备全血，取全血20 μL 用血细胞稀释液稀释，室温下放置3 min，血细胞分析仪进行外周血象检测。

中国古典艺术批评对艺术创造波谲云诡的兴发过程把握，往往能体贴生动，曲折尽致，典型如郑板桥论述艺术创造:

2.6 脏器指数测定

在照射后第7 d 称重，颈椎脱臼处死，解剖取胸腺、脾脏，除去脂肪及血污，滤纸吸干，称重。按公式计算相应的脏器指数(%)。脏器指数(%)=脏器重量(g)/动物体重(g)×100%

2.7 骨髓DNA 含量测定

分别在照射后第7 d 颈椎脱臼处死剥离右侧股骨，除净组织及污血;剪断第二股骨，用10 mL 0.005 mol/L CaCl2将全部骨髓冲入离心管中，反复冲洗直至股骨冲成白色为止。冲好的骨髓液置于4 ℃冰箱30 min，取出后2500 rpm 离心15 min，弃上清液，沉淀中加入5 mL 0.2 mol/L HClO4酸化，将沉淀物充分混匀，90 ℃水浴加热15 min，流水冷却，滤纸过滤，滤液用紫外可见分光光度计在260 nm 处测定吸光度A 值。

2.8 肝脏抗氧化酶活性测定

在照射后第7 d 称重，颈椎脱臼处死，解剖取肝脏，精密称取0.2 g 组织，用电动匀浆机制备10%匀浆，2000 rpm 离心10 min 取上清，SOD、GSH、CAT、MDA、T-AOC 及总蛋白检测参照试剂盒方法。

2.9 Caspase-3 和Caspase-6 的测定

在照射后第7 d，摘眼球取血于EP 管，3000 rpm，10 min，分离血清。向酶标板中加入样品及标准品，生物素标记的二抗和酶标试剂，37 ℃反应60 min，洗板5 次，加入显色液A、B，37 ℃显色10 min，加终止液，酶标仪读OD 值。

2.10 统计学分析

用单因素ANOVA 方差分析，组间两两比较采用LSD 法，检验水准a=0.05。

3 实验结果

采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计处理，所有数据均以均数±标准差()表示，多组比较采

3.1 黑果枸杞对辐射小鼠血象的影响

表1 显示空白组WBC、RBC、HGB、明显高于辐射组(P＜0.01)，说明造模成功。黑枸杞高中低剂量组RBC，HGB 高于辐射组(P＜0.01)，而WBC、PLT 无统计学意义。黑枸杞能增加RBC，HGB 的量但效果不如阳性药物(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 黑果枸杞对辐射小鼠血象的影响(，n=10)Table 1 Effect of L.ruthenicum on the hemogram of mice after radiation(，n=10)

表1 黑果枸杞对辐射小鼠血象的影响(，n=10)Table 1 Effect of L.ruthenicum on the hemogram of mice after radiation(，n=10)

注:与模型组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与阳性组比较#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group #P＜0.05，##P＜0.01.

3.2 黑果枸杞对辐射小鼠脏器指数与DNA 含量的影响

表2 显示黑枸杞中剂量与低剂量组DNA 含量高于辐射组(P＜0.01，P＜0.05)，但低于阳性药物(P＜0.01)胸腺指数与脾脏指数无明显差别(P ＞0.05)。说明黑枸杞对免疫系统无明显影响。

表2 黑果枸杞对辐射小鼠脏器指数的影响(，n=10)Table 2 Effect of L.ruthenicum on the organ weight index and DNA content of mice after radiation(，n=10)

表2 黑果枸杞对辐射小鼠脏器指数的影响(，n=10)Table 2 Effect of L.ruthenicum on the organ weight index and DNA content of mice after radiation(，n=10)

注:与模型组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与阳性组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group，#P＜0.05，##P＜0.01.

3.3 黑果枸杞对辐射小鼠抗氧化酶活性影响

表3 显示黑枸杞能提高辐射小鼠SOD 活力(P＜0.01)，甚至优于阳性药物(P＜0.01)减少脂质过氧化产物MDA 的量(P＜0.01)但是CAT、GSH-PX的活力降低(P＜0.05)，尤以低剂量明显(P＜0.01)，对T-AOC 无明显影响。

3.4 黑果枸杞对辐射小鼠caspase-3 及caspase-6的影响

表4 显示黑枸杞低剂量组Caspase-3 的含量与模型组相比明显降低(P＜0.01)，空白组Caspase-3的含量比辐射模型组低(P＜0.05)。Caspase-6 的空白组、黑枸杞中、低剂量组的含量要低于模型组(P＜0.01)。但高剂量组Caspase-3 和Caspase-6 的含 量升高，但无统计学差异。

表3 黑果枸杞对辐射小鼠抗氧化酶活力的影响(，n=10)Table 3 Effect of L.ruthenicum on the activity of antioxidant enzyme of mice after radiation(，n=10)

表3 黑果枸杞对辐射小鼠抗氧化酶活力的影响(，n=10)Table 3 Effect of L.ruthenicum on the activity of antioxidant enzyme of mice after radiation(，n=10)

注:与模型组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与阳性组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group，#P＜0.05，##P＜0.01.

表4 黑果枸杞对辐射小鼠凋亡因子的影响(，n=10)Table 4 Effect of L.ruthenicum on the caspase-3 and caspase-6 of mice after radiation(，n=10)

表4 黑果枸杞对辐射小鼠凋亡因子的影响(，n=10)Table 4 Effect of L.ruthenicum on the caspase-3 and caspase-6 of mice after radiation(，n=10)

注:与模型组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与阳性组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group，#P＜0.05，##P＜0.01.

4 讨论

血液系统是辐射敏感的靶器官，辐射后小鼠的血象明显降低，而黑枸杞增加了RBC 与HGB 的含量，RBC 和HGB 都是运输氧气的重要介质，说明黑枸杞是通过增加辐射后小鼠体内的氧气来对血液系统进行保护的。白细胞是机体的免疫因子，能间接反映机体的免疫力，而黑枸杞无明显调节作用，说明其对机体的免疫系统影响不是通过增加白细胞数量来调节的，这一点在表2 中的脏器指数也得到证实，胸腺与脾脏是重要的免疫器官，而胸腺指数与脾脏指数无明显变化，更加说明黑枸杞可能对机体的免疫系统无明显影响，这一具体机制，需进一步研究。辐射后DNA 含量黑枸杞中剂量与低剂量组明显增高，提示其对DNA 具有保护作用。

细胞凋亡因子与DNA 的修复关系密切，其中Caspase-3 和Caspase-6 是Caspase 家族的凋亡执行因子，二者同源性高，并且活化的Caspase-6 可以激活Caspase-3。Caspase-3 作为Caspase 家族的最重要成员，它的活化标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段［4］。Caspase-3 的激活可以切割参与DNA 修复的PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)，而PARP 可以催化二磷酸腺苷核糖聚合物从异柠檬酸脱氢酶向靶蛋白的转移，激活重要的修复因子，从而来达到DNA修复的目的［5-7］。辐射对DNA 造成严重的损伤，而前述已提到黑枸杞对DNA 有保护作用，并且黑枸杞能降低Caspase-3 的量，那么就能减少Caspase-3 对PARP 的切割，从而提高机体对DNA 的修复能力，减少细胞的凋亡。Caspase-6 是唯一一个可以剪切层蛋白的Caspase 成员，在细胞凋亡过程中，切割片层素蛋白，导致核纤层崩解，继而使染色体凝集，细胞死亡［8］。黑枸杞能降低Caspase-6 的量，减少片层素蛋白的切割，保护染色体。辐射造成DNA 损伤，可能会引起细胞的癌变，那么这时降低Caspase-3 和Caspase-6 的量则导致肿瘤细胞的大量增殖。本实验阳性药物氨磷汀具有对细胞凋亡的双重调节作用，即对肿瘤细胞增加凋亡因子的活性，对正常细胞抑制凋亡因子的活性［9］。表2 及表4 中可看出氨磷汀具有明显的保护DNA 和降低caspase-3，caspase-6活性的作用，说明此实验照射条件下的小鼠在第七天未发生癌变。那么黑枸杞降低细胞凋亡因子的作用是对机体有益的。

辐射后体内的活性氧(ROS)自由基大量增加，而ROS 是Caspase 激活的上游信号［10］，黑枸杞水提物含有花青素与原花青素，这两个物质含有酚羟基，可以直接使自由基熄灭，这可能是黑枸杞降低Caspase-3 和Caspase-6 的机制。机体主要通过5 种途径来提高抗氧化的能力:1.熄灭自由基;2.抑制氧化应激和凋亡的生物学改变;3.增加抗氧化酶活性;4.降低膜的流动性，抑制脂质过氧化;5.增加抗氧化蛋白的表达。表3 结果表明黑枸杞水提取液是通过增强SOD 活性来清除辐射所引起的自由基，MDA含量明显减少，但其他抗氧化酶活性降低，T-AOC尤以低剂量降低明显，反而辐射组的T-AOC 较强，可能自由基的产生能使机体代偿的增强抗氧化能力，但由于辐射对DNA 的损伤，使代偿作用无法比空白组的酶活性强，而黑枸杞含有酚羟基，直接熄灭自由基，使机体的代偿减弱或消失，从而会抑制到CAT、GSH-PX、T-AOC 的活性。自由基的产生是一个动态平衡的过程，过多会损伤机体，而适量的自由基又有益于机体，所以当黑枸杞水提取物熄灭自由基后，机体的抗氧化酶活性降低，使得自由基达到动态平衡，这可能也是酶活性降低的一个原因。

辐射对机体的最重要损伤是DNA，而引起DNA损伤的“元凶”就是自由基，并且自由基对免疫系统也有破坏，但是机体也需要适量的自由基，其可激活体内的一些合成酶和解毒酶［11，12］，但是自由基是否也能增强抗氧化酶的活性，以及激活酶的机制是如何，这都有待进一步研究。

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