PEEK/HA生物复合材料对3T3成纤维细胞的影响*

倪 卓，杨 莎，王 应，刘士德，张建华，田生礼

（1.深圳大学 化学与化工学院，广东 深圳 518060；2.深圳大学 生命科学学院，广东 深圳 518060）

PEEK/HA生物复合材料对3T3成纤维细胞的影响*

倪 卓1，杨 莎1，王 应2，刘士德2，张建华2，田生礼2

（1.深圳大学 化学与化工学院，广东 深圳 518060；2.深圳大学 生命科学学院，广东 深圳 518060）

体外研究PEEK/HA生物复合材料对3T3成纤维细胞的影响，评价该材料的生物相容性。制备不同HA含量的PEEK/HA和PEEK/SPEEK/HA生物复合材料，与3T3成纤维细胞共培养，倒置相差显微镜观察该材料对细胞形态影响，MTT法研究该材料对细胞增殖作用，评价细胞毒性，流式细胞术研究该材料对细胞凋亡的影响，扫描电镜观察该细胞在材料表面黏附形态。细胞呈长梭形贴壁生长，胞体透明，大部分呈梭形和多角形，生长态势良好。随着浸提液浓度增大，材料对细胞增殖作用显著下降，PEEK/HA复合材料随着HA含量增加，细胞增殖作用逐渐增强，PEEK/SPEEK/HA复合材料与PEEK/HA相比，对细胞增殖作用较强，细胞毒性级别为Ⅰ级，说明该材料对3T3细胞无毒性。细胞凋亡率随PEEK/SPEEK/HA材料中的HA含量升高而降低。SPEEK的加入使PEEK/HA复合材料后黏附率增大，随PEEK/SPEEK/HA中HA含量增加，细胞黏附率增加，SPEEK和HA可改善材料的黏附性能。SEM观察发现3T3细胞能够在PEEK/SPEEK/HA复合材料表面黏附、伸展和生长。PEEK/SPEEK/HA复合材料生物相容性良好，为该人工骨替代材料的临床前研究提供实验数据和科学依据。

磺化聚醚醚酮；PEEK/SPEEK/HA复合材料；3T3成纤维细胞；细胞增殖；生物活性

前言

成纤维细胞（Fibroblast，FB）是疏松结缔组织的主要细胞成分，是重要的创伤修复细胞，在组织的创伤修复的过程中充当重要角色[1]。研究表明，骨创伤（以骨折为例）的愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段，成纤维细胞参与了创伤后的局部血肿机化到肉芽组织生成和纤维性骨痂的形成到骨性骨痂的演变过程[2]，即成纤维细胞具有诱导成骨和最终形成骨组织的能力。骨组织的形成和修复是体内多种细胞协同作用下的结果，在骨修复材料生物相容性研究背景下，除了对骨和骨膜来源的成骨细胞的进行研究，对作为骨外组织来源的成骨潜能细胞的成纤维细胞进行研究也必不可少[3]。将聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）和羟基磷灰石（Ca10（PO4）6（OH）2,Hydroxyapatite, HA）制备成PEEK/HA生物复合材料，比其它树脂基生物医用复合材料的力学性能高，并具有良好的生物活性[4～5]。但是HA的加入降低了PEEK/HA复合材料的强度，目前的技术使该材料强度还不能达到人体承力骨的性能要求[6～7]。研究表明，磺化聚醚醚酮（sulfnated poly（ether ether ketone）,SPEEK）可以吸附碳酸钙表面的活性基团（如羟基），形成新的化学键合，与碳酸钙颗粒表面有良好的相互作用，有助于在基体与填料之间形成良好的界面层[8]。因此把SPEEK引入到PEEK/HA中制成新型PEEK/ SPEEK/HA复合材料，可改善PEEK和HA之间的界面性能，提高PEEK/HA材料的力学性能。目前该复合材料对3T3细胞生物相容性研究未见报道，本文将PEEK/HA复合材料和PEEK/SPEEK/HA复合材料与3T3成纤维细胞共培养，研究材料对3T3成纤维细胞形态和生物学功能可能造成的影响，体外评价该材料对3T3成纤维细胞相容性。通过实验数据的比较，研究该材料对3T3细胞增殖、毒性、凋亡和黏附的影响，建立复合材料组分含量与3T3成纤维细胞生物活性之间的关系，为深入研究PEEK/SPEEK/HA人工骨材料提供实验数据和科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与仪器

PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/10% HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30%HA（本实验室制备）；3T3成纤维细胞（上海生命科学院）；RPM11640培养基（Hyclone公司）；小牛血清（Thermo Fisher公司）；磷酸盐缓冲剂（PBS，Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（苏州碧云天公司）；5%噻唑蓝（MTT，sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Amresco公司）；凋亡双染试剂盒（南京凯基）；酶联检测仪（Imark，美国Bio-Rad公司）；高压灭菌锅（HV-50，HIRAYAMA公司）；荧光相差倒置显微镜（X71，OLYMPUS公司）；流式细胞仪（FACSCALIBUR，美国BD公司）SU-70热场发射SEM（日本日立）。

1.2 实验方法

1.2.1 材料浸提液制备

PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/30%HA、 PEEK/SPEEK/10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/ SPEEK/30%HA经高压灭菌后，用RPMI1640培养基按4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL、32mg/mL和64mg/mL配成不同浓度的混悬液，37℃恒温箱中静置浸提48h，离心后4℃冰箱保存备用。

1.2.2 细胞标准生长曲线测定

将对数生长期的3T3细胞制备成7种不同浓度（0.5×104～3.5×104个/mL）细胞悬液，并依次加入96孔培养（100μL/孔，n=3）。置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h，再加入5%MTT（20μ L/孔）继续培养4h。弃掉培养液，用0.1mmol/L的PBS液清洗后，用胰蛋白酶（0.25%，w/v）消化细胞，加入DMSO（150μ L/孔）室温下孵育15～20min，用酶联检测仪，测其570nm处OD值，计算出各浓度组均值，作生长曲线[9～10]。

1.2.3 细胞形态实验

细胞对数生长期时，弃去原培养液，用PBS洗涤2次。用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，用含10%牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，细胞板计数，按每孔2×104个/mL接种在96孔板，每孔体积200μ L。24h细胞贴壁后，吸去培养液，加入材料浸提液、5%CO2置于37℃培养箱中培养24h。在荧光相差倒置显微镜下观察细胞的形态及细胞贴壁情况，采集图像。

1.2.4 细胞黏附率测定

将PEEK/10%HA、PEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/ 10%HA、PEEK/SPEEK/20%HA、PEEK/SPEEK/30% HA分别制备成5mm×2mm大小圆柱体，经过高温高压灭菌后，置于12孔细胞培养板中，将细胞以2×104个/mL的密度加入到细胞培养板中，每孔0.5mL，于37℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度条件下培养，培养48h后，将材料取出，培养板残余细胞消化收集、计数。材料的细胞黏附率=（总细胞数-未黏附细胞数）／总细胞数×100%。

1.2.5 细胞毒性试验

细胞对数生长期时，弃去原培养液，PBS洗涤2次。用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，用含10%牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，细胞板计数，按每孔2×104个/mL接种在96孔板（n=3），每孔体积200μ L。24h细胞贴壁后，吸去培养液，换成材料浸提液，将培养板移入5%CO2中，在37℃及饱和湿度条件下培养。每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，在37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。用胰蛋白酶（0.25%，w/v）消化细胞，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

1.2.6 细胞凋亡实验

经灭菌的模压材料分别置于12孔板中，将处于对数生长期的3T3细胞配制成2×105个/mL的细胞悬液，滴加在材料上，培养48h后，PBS清洗材料并消化收集细胞，待测细胞用PBS（pH=7.4）缓冲液冲洗2次，每次2000rpm离心5min，然后弃上清液加入500μ LBindingBuffer重悬细胞，移至测量管中后每管加人5μ LAnnexinV-FITC和5μ LPI，室温下避光孵育15min，流式细胞仪上样检测。Cell Quest软件进行数据分析，以Annexin-V+/PI-判断为早期凋亡，以Annexin-V+/PI+判断为晚期凋亡，两种凋亡率之和为总凋亡率。

1.2.7 扫描电镜实验

经灭菌的PEEK/SPEEK/HA模压材料置于12孔板中，取对数生长期3T3细胞配制成2×104个/mL的细胞悬液，滴加在材料上，培养5d后（每天换新鲜培养液），取出材料，PBS清洗材料2次，放入EP管中，加入2.5%戊二醛，固定3～4h，PBS冲液洗涤3次，吸弃戊二醛，用30%，50%，70%，85%，90%梯度乙醇脱水各一次，每次15min，100%无水乙醇脱水2～3次，置于真空冷冻干燥机干燥过夜，将样品固定在样品台上，喷金镀膜，扫描电镜观察二次电子图像。

2 结果与讨论

2.1 3T3成纤维细胞标准生长曲线

图1 3T3成纤维细胞标准生长曲线Fig.1 The standard growth curve of 3T3 fibroblasts

细胞标准生长曲线是判定细胞活力的重要指标，也是培养细胞生物学特性的基本参数之一，可以准确描述整个过程中细胞数目的动态变化。图1显示3T3细胞数-OD值生长曲线，在0.5×104～2× 104个/mL范围内是3T3细胞的生长潜伏期，在接种细胞数为2×104～3×104个/mL范围内为对数生长期，大于3×104个/mL后进入平台期。在细胞培养实验时，接种细胞的密度对生长曲线的影响较大，接种密度过高或过低都不利于细胞生长，影响检测结果，本实验选择接种细胞数在对数期生长范围内操作。

2.2 材料对细胞形态的影响

细胞培养到第2天时，用倒置相差显微镜观察各组材料对细胞形态的影响。黑色颗粒物为材料，梭形和三角形为正常活细胞，圆形为悬浮死细胞。图2（g）显示空白对照组中的3T3细胞，细胞呈长梭形贴壁生长，胞体透明，大部分呈梭形和多角形，可以观察到早期圆形分裂细胞。图2（a、c、d）显示3T3细胞在PEEK/HA复合材料中生长，细胞几乎都贴壁生长，呈梭状，胞体透明，折光性较好，随着HA含量增加，3T3细胞数目增多。图 2（b、e、f）显示PEEK/SPEEK/HA对细胞形态的影响，细胞多数贴壁生长，呈梭状或三角形，折光性好，PEEK/SPEEK/HA材料中的HA含量增加，3T3细胞数目增多，其中PEEK/SPEEK/30%HA组细胞形成连接，生长态势良好，表明HA含量增加可以促进细胞增殖。比较PEEK/ HA和 PEEK/SPEEK/HA材料发现，SPEEK引入PEEK/HA复合材料使3T3细胞密度增大，说明PEEK/ SPEEK/HA促进细胞增殖的作用比PEEK/HA强。

图2 复合材料对细胞形态的影响（×200）Fig.2 The influence of the composites on 3T3 cells morphology

2.3 细胞黏附率

细胞在材料上的黏附是细胞进一步生长、分化的基础，也是衡量材料生物相容性的重要指标之一。细胞的活力、材料性状及环境都可以影响细胞与材料的黏附，而材料表面的理化特性和形貌对细胞黏附起关键性作用。材料的细胞黏附率见表1。PEEK/HA复合材料随着HA含量的增加，细胞黏附率增加，PEEK/SPEEK/HA复合材料随着HA含量的增加，细胞黏附率增加，并且黏附率都高于PEEK/HA复合材料，说明SPEEK，HA加入能改善材料对细胞的黏附性能。研究认为[11]，材料表面结构不同有不同的生物特性，比如羟基、酰胺基等，有利于细胞的生长黏附。由于HA中含有羟基，SPEEK含有磺酸基，故对细胞黏附有促进作用。

表1 复合材料的细胞黏附率Table 1 The adhesion rates of 3T3 cells on the composites

2.4 浸提液浓度对细胞增殖作用

分别于第1、2、3、4d检测各组材料不同浓度下的细胞OD值，以浓度对数为横轴，OD值为纵轴作增殖曲线，见图3。PEEK/HA复合材料在4mg/mL时，OD值最高，细胞增殖作用最强，随着浸提液浓度增加，PEEK/HA复合材料的OD值减小，曲线下滑，在64mg/mL时对细胞增殖促进作用最弱。PEEK/SPEEK/ HA复合材料对细胞的浓度效应作用与PEEK/HA复合材料类似，主要原因是其基底材料为PEEK/HA，SPEEK作为类似偶联剂加入量较少，约占2%，所以浓度改变后，趋势与PEEK/HA复合材料一致。

图3 PEEK/HA复合材料浓度对细胞增殖的影响Fig.3 The influence of different concentrations of the composites on cell proliferation

2.5 培养时间对细胞增殖的影响

图4（a、b、c）显示PEEK/HA和PEEK/SPEEK/HA复合材料的随时间变化的生长曲线，与PEEK/HA复合材料相比，PEEK/SPEEK/HA复合材料的细胞生长曲线位于PEEK/HA上方，表明PEEK/SPEEK/HA复合材料对3T3细胞增殖作用比PEEK/HA复合材料要强。图4（d）显示的是含不同HA含量的PEEK/ SPEEK/HA复合材料对细胞的生长曲线的影响，PEEK/SPEEK/HA复合材料的生长曲线趋势与空白对照相似，随着材料中HA含量增加，细胞生长曲线向上平移，更接近空白对照组，其中PEEK/SPEEK/ 30%HA材料对细胞的增殖促进作用较大，表明HA含量增加，能改善复合材料对细胞的增殖作用。

图4 复合材料随时间对细胞增殖影响Fig.4 The influence of the composites on cell proliferation with incubation time

2.6 材料毒性评级

细胞增殖率（relative proliferation rate,RGR）=材料组OD值/阴性对照组OD值×100%。根据不同时期各组RGR值采用五分制法进行细胞毒性分级（CTS），观察材料作用的剂量效应。细胞毒性分级标准为:CTS 0级RGR≥100%;75%～99%为Ⅰ级; 50%～74%为Ⅱ级;25%～49%为Ⅲ级;1%～24%为Ⅳ级；RGE＜1%为Ⅴ级。0级和Ⅰ级被认为无细胞毒性；Ⅱ级为轻度细胞毒性；Ⅲ级和Ⅳ级表示有细胞毒性，Ⅴ级为明显细胞毒性[12]。表2为材料对3T3细胞的RGR值和毒性评级。各材料组RGR平均值与空白对照相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图5。毒性评级均为Ⅰ级，材料对细胞无细胞毒性。随着培养时间的增长，RGR值在第2天到第4天都出现减少再增大的变化，说明细胞能适应材料，进行增殖。PEEK/SPEEK/HA的RGR比PEEK/HA大，表明PEEK/SPEEK/HA对细胞增殖促进作用强于PEEK/HA。HA含量增加，RGR值增加，其中PEEK/ SPEEK/30%HA的RGR值最大，对3T3细胞增殖促进作用最大。

表2 复合材料的毒性级别Table 2 The toxicity levels of composites

图5 细胞相对增殖率（RGR）比较Fig.5 The comparison of cell RGR

2.7 细胞凋亡率

细胞凋亡是在一系列基因的激活、表达以及调控等生理性的作用下，为维持内环境稳定的细胞自主的有序的死亡[13]。Annexin V-FITC可以与细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PhosPhatidylserine，PS）特异结合，碘化丙啶（ProPidium iodide，PI）是一种核酸染料，可与细胞核结合呈现红色。早期凋亡细胞普遍有PS外翻现象，Annexin V-FITC可以特异性结合PS，但大分子PI不能穿过活性细胞膜而不能与核酸结合；晚期凋亡细胞胞膜完整性遭到破坏，Annexin V-FITC可以特异性结合PS，同时PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色，所以Annexin V-FITC/PI双染细胞可检测细胞的早晚期凋亡情况[14]。凋亡率为早期凋亡率和晚期凋亡率之和，表3为PEEK/ SPEEK/HA复合材料对3T3细胞凋亡率和凋亡类型的影响。与空白对照组相比，材料组晚期凋亡均有所升高，PEEK/SPEEK/10%HA和PEEK/SPEEK/20% HA使3T3细胞凋亡率升高，PEEK/SPEEK/30%HA使3T3细胞凋亡率降低，凋亡率从大到小依次为PEEK/SPEEK/10%HA>PEEK/SPEEK/20%HA>PEEK/ SPEEK/30%HA。表明随着HA含量的增加，细胞凋亡下降，说明PEEK/SPEEK/30%HA的细胞相容性最好，对细胞毒性最小。这与其他相关研究分析的结果是一致[15]，因为HA是骨骼材料有效成分，故对细胞毒性小。此外在各个样本的测定中，未见明显的细胞坏死发生，这说明所有材料中基本不会对细胞产生较大的毒害作用。故PEEK/SPEEK/HA复合材料无明显细胞毒性，细胞相容性较好。

表3 PEEK/SPEEK/HA复合材料对3T3细胞凋亡率的影响Table 3 The influence of PEEK/SPEEK/HA composites on the apoptosis rate of 3T3 cells

2.8 细胞形态

选取PEEK/SPEEK/20%HA复合材料，扫描电镜观察3T3细胞在该材料上生长形态。3T3细胞为三角形或长梭形，伸展状态良好，细胞长出伪足紧密贴在材料表面附着生长，见图6（a）。图6（b）显示3T3细胞在材料缝隙处生长，附着较牢固，细胞间连接紧密，有的可见到细胞外基质（ECM）的分泌。图6（a）显示大量细胞在材料表面成片生长，包覆在材料表面。表明3T3细胞能够在PEEK/SPEEK/HA复合材料表面黏附、伸展和生长，具备成为骨替代材料的条件。这些结果与前文形态学和黏附率研究结果相吻合，生物相容性良好。

图6 3T3细胞在材料表面形态Fig.6 The morphology of 3T3 cells on the composites surface

3 结 论

材料的生物相容性检测是该领域不可缺少的重要组成部分，理想的生物材料应当具有良好的细胞相容性、能够促进细胞增殖和组织形态的形成。从体外细胞生物学角度，通过形态学实验、细胞黏附实验、细胞增殖实验、细胞凋亡实验和扫描电镜实验，研究了PEEK/HA复合材料和PEEK/SPEEK/ HA复合材料对3T3成纤维细胞形态和生物学功能造成的影响，评价了材料的细胞毒性。细胞毒性评价显示，该复合材料对3T3成纤维细胞的毒性级别为Ⅰ级，无明显细胞毒性。细胞形态研究显示，细胞形态正常，生长态势良好，复合材料组与空白对照组相比无显著差异。细胞黏附实验表明，PEEK/ SPEEK/HA复合材料的黏附率大于PEEK/HA复合材料的黏附率，HA含量增加黏附率增加，其中PEEK/SPEEK/30%HA的黏附率最大。细胞增殖实验检测结果表明3T3细胞易于在PEEK/HA复合材料上生长，增殖情况较好，符合3T3细胞的生长规律。随着浸提液中复合材料浓度的增大，生长曲线呈下降趋势，在4mg/mL时，对细胞增殖促进作用较强，浓度达到64mg/mL时，对3T3成纤维细胞增殖促进作用降到最低。PEEK/SPEEK/HA复合材料对细胞增殖的作用比PEEK/HA复合材料强，而且随HA含量增加，PEEK/SPEEK/HA复合材料对细胞增殖的作用增强。细胞凋亡实验表明，细胞无明显坏死，细胞凋亡率随PEEK/SPEEK/HA材料中的HA含量升高而降低。因此，SPEEK的加入以及HA含量的增加能够改善PEEK/HA复合材料的生物相容性。经SPEEK修饰以后的PEEK/HA复合材料对细胞表现出较好的黏附性，为细胞的附着、生长、增殖提供了良好的微环境，超微结构观察显示，3T3细胞能够紧密地附着于PEEK/SPEEK/HA材料表面，细胞之间形成紧密联结，周围可观察到ECM的分泌，3T3细胞能够在PEEK/SPEEK/HA复合材料表面黏附、伸展和生长，作为骨修复材料有一定的研究价值，具有良好的生物相容性，为下一步应用于体内研究和临床研究提供了实验数据和科学依据。

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The Influence of PEEK/HA Bio-composites on 3T3 Fibroblasts

NI Zhuo1,YANG Sha1,WANG Ying2,LIU Shi-de2,ZHANG Jian-hua2and TIAN Sheng-li2
（1 College of Chemistry and Chemical Engineering,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China;2 College of Life Science,Shenzhen University, Shenzhen 518060,China）

The PEEK/SPEEK/HA composites and PEEK/HA composites with different HA contents were prepared,and the fibroblasts were cultured with the composite materials.The influences of PEEK/HA bio-composites on 3T3 fibroblasts in vitro were researched,and biocompatibility of the materials was evaluated.The cell morphology was observed by inverted fluorescence microscope.The MTT method was used to study the cell proliferation under various conditions to evaluated cytotoxicity.The effect of this material on the apoptosis was studied by flow cytometry,and the cells adherent morphology on the material surface was observed by SEM.With the increasing of concentration of the composites extracts,the cell proliferation was decreased,and with increasing the HA in PEEK/HA material,the cell proliferation was enhanced.Compared with PEEK/HA material,the PEEK/SPEEK/HA had a greater effect on cell proliferation and with the increasing of HA content,PEEK/SPEEK/HA materials could accelerate cell proliferation.The cytotoxicity of PEEK/SPEEK/HA composite and PEEK/HA composite was I level,it indicated that the materials were non-cytotoxic. With the increasing of HA content in PEEK/SPEEK/HA materials,the apoptosis rate reduced.After the SPEEK was added to PEEK/HA composite, the adhesion rate increased,with the increasing of HA content in PEEK/SPEEK/HA,the cell adhesion rate also increased,it showed that the SPEEK and HA could improve the adhesion properties of the materials.3T3 cells could adhere,stretch and grow on the surface of PEEK/SPEEK/HA composites,and the PEEK/SPEEK/HA composite materials had good biocompatibility,and this research would provide experimental data and scientific basis for pre-clinical studies on artificial bone substitute materials.

SPEEK;PEEK/SPEEK/HA composites;3T3 fibroblasts;cell proliferation;biological activity

TQ322.97

A

1001-0017（2015）04-0231-07

2015-03-27 *基金项目：广东省教育厅科技创新项目（编号：2013KJCX0163）；深圳大学应用技术开发项目（编号：201223）

倪卓（1963-），男，吉林通化人，博士，教授，主要从事高分子材料方面的研究。