RNAi对胃癌SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响*

裴 波，寸英丽，姚 乾，张凯恋，覃向南，代佑果，查 勇

(1.昆明医科大学研究生院，昆明 650500；2.昆明医科大学附属第三医院腹部外科，昆明 650118；3.云南省肿瘤医院肿瘤研究所，昆明 650118)

论著·基础研究

RNAi对胃癌SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响*

裴 波1，寸英丽2△，姚 乾3，张凯恋1，覃向南1，代佑果2，查 勇2

(1.昆明医科大学研究生院，昆明 650500；2.昆明医科大学附属第三医院腹部外科，昆明 650118；3.云南省肿瘤医院肿瘤研究所，昆明 650118)

目的 运用RNA干扰(RNAi)技术抑制HER2基因的表达，探讨其对胃癌SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响。方法设计、构建RNAi片段靶向抑制HER2高表达的胃癌细胞株(HER2-RNAi组)，以转染阴性对照系列(阴性对照组)及未转染的SGC-7901细胞(空白对照组)为对照组。利用RT-PCR和Western blot法检测各组胃癌SGC-7901细胞中HER2的表达情况；采用Transwell小室模型及划痕实验检测RNAi对胃癌细胞体外的侵袭和迁移能力的影响。结果RNAi片段转染后SGC-7901细胞的HER2 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05)；侵袭实验结果显示,HER2-RNAi组的穿膜细胞数[(31.5±3.8)个/视野]显著低于未转染组[(103.6±4.5)个/视野]；迁移实验结果显示，HER2-RNAi组的穿膜细胞数[(63.6±5.1)个/视野]显著低于未转染组[(193.5±6.2)个/视野]，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论RNAi沉默HER2基因可以抑制胃癌SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力，提示RNAi基因沉默技术有可能成为进展期胃癌治疗的新方法。

胃肿瘤；RNA干扰；肿瘤转移；HER2基因

胃癌在全球最常见的恶性肿瘤中排名第4位，同时也是世界范围内第2位致死性肿瘤[1]。目前，尽管有手术、化疗和放疗等多种治疗手段综合治疗胃癌，但对于进展期胃癌患者总体疗效欠佳，其5年生存率仍低于30%[2]。随着分子生物学的发展及对胃癌发病机制研究的深入，目前，已认识到胃癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程，在基因水平研究胃癌的治疗成为近年研究热点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发展起来的一种从基因的角度治疗疾病的新技术，RNA中极少量的siRNA就能特异有效地抑制相应基因的表达[3]。本研究采用RNA干扰技术下调胃癌SGC-7901细胞中HER2基因的表达，观察其对胃癌细胞株SGC-7901侵袭迁移能力的影响，旨在为胃癌转移的基因靶向治疗提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株SGC-7901(云南省肿瘤研究所常规保存)；质粒pGPU6/GFP/Neo-HER2和阴性质粒(pGPU6/GFP/Neo-shNC，上海吉玛公司)；RPMI-1640培养液、胎牛血清(美国Hyclone公司)；脂质体Lipofectamine2000、TRIzol试剂、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、Matrigel胶(日本TAKARA公司)；Transwell小室(美国Coning公司)；RIPA裂解液(索莱宝)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；兔抗人HER2单克隆抗体(Bioss antibody公司)；β-actin、山羊抗兔IgG-HRP(signalway antibody公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 (1)细胞培养：将存在HER2蛋白表达[4]的胃癌SGC-7901细胞株用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。(2)细胞转染：根据HER2(NM_001005862)基因信息利用siRNA设计原则与方法设计siRNA序列[5]，送上海吉玛公司合成，选取含有干扰HER2效果最佳的靶点序列pGPU6/GFP/Neo-HER2 (5′-GGG CAG TTA CCA GTG CCA AT-3′)，以及阴性对照组的pGPU6/GFP/Neo-shNC序列(5′-GTT CTC CGA ACG TGT CAC GT-3′)，按照转染手册转染至SGC-7901细胞中，制备成稳定转染HER2-RNAi的SGC-7901细胞(HER2-RNAi组)及阴性对照细胞(阴性对照组)；并收集同期未转染的SGC-7901细胞设为空白对照组。转染后24 h观察细胞。

1.2.2 RT-PCR检测HER2 mRNA的表达 应用TRIzol试剂提取细胞总RNA，按TaKaRa公司提供的反转录试剂盒和荧光定量试剂盒进行操作，并以GAPDH为内参照。HER2上游引物为5′-TCC GTT TCC TGC AGC AGT C-3′，下游引物为5′-AGA GAG CCA GCC CTC TGA CGT CCA T-3′；内参基因GAPDH上游引物为5′-GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3′，下游引物为5′-AGC CAA ATT CGT TGT-3′。反应体系20 μL，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。

1.2.3 Western blot检测HER2蛋白的表达 提取各组细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每组取20 μL蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳产物以250 mA恒流电转至PVDF膜，用3%BSA封闭液室温于摇床上摇动封闭2 h，用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)漂洗后置于稀释的I抗(HER2为1∶500；β-actin为1∶3 000)中4 ℃孵育过夜，再次PBST漂洗后加入稀释的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室温置于摇床上孵育2 h，洗膜后进行显影、定影，行图像分析。

1.2.4 细胞侵袭和迁移实验 应用无血清的冷DMEM按1∶6稀释Matrigel基质胶，在24孔板的细胞培养孔中置入Transwell小室，在上室覆盖100 μL稀释胶，室温干燥过夜。HER2-RNAi转染组细胞及未转染组细胞培养48 h后，应用无血清的DMEM调整细胞密度至5×105/mL，转移至Matrigel包被的Transwell小室中，小室下层加入含10%血清的DMEM。37 ℃培养24 h后，用棉签拭去非侵袭性细胞，然后用结晶紫固定并染色，在100倍荧光显微镜下计数细胞。细胞迁移实验步骤除Transwell小室不铺胶外，其余方法同侵袭实验。

1.2.5 细胞划痕实验 以6孔细胞培养皿培养HER2-RNAi转染组细胞及未转染组细胞，生长24 h后用移液枪头在培养皿中划痕，加入无血清培养基。放入5%CO2培养箱，37 ℃培养24 h取样，拍照。

2 结 果

2.1 载体成功转染并获得HER2稳定表达的SGC-7901细胞 转染24 h后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞，HER2-RNAi组与阴性对照组中大多数细胞都荧光着色，与背景形成明显反差，表明pGPU6/GFP/Neo-HER2与pGPU6/GFP/Neo-shNC载体成功转染进入SGC-7901细胞株并获得稳定表达HER2蛋白，见图1。

图1 荧光显微镜观察载体转染SGC-7901细胞后影像表现(×100)

表1 RT-PCR检测各组细胞中HER2 mRNA的相对表达量

2.2 RT-PCR检测各组胃癌SGC-7901细胞中HER2 mRNA的表达 结果显示，干扰组细胞HER2的mRNA表达水平相对于阴性对照组及空白对照组明显下降，干扰效率为73.8%，差异有统计学意义(P<0.01)，而阴性对照组较空白对照组细胞HER2的mRNA表达则无明显改变(P>0.05)，提示本实验设计的siRNA能有效地沉默HER2基因，见表1。

2.3 Western blot检测各组胃癌SGC-7901细胞中HER2蛋白的表达 HER2-RNAi组与阴性对照组及空白对照组比较，细胞内HER2蛋白的表达下调，HER2-RNAi组的HER2蛋白相对表达量降低了53.9%和52.2%，差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组间内参β-actin表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

1:空白对照组；2：阴性对照组；3：HER2-RNAi组。

图2 Western blot检测各组细胞中HER2蛋白的表达

2.4 RNAi对胃癌SGC-7901细胞体外侵袭和迁移能力的影响 在倒置显微镜下观察，穿膜细胞被染成紫蓝色。Transwell小室模型法检测结果显示，HER2-RNAi组细胞侵袭穿膜细胞的数量为(31.5±3.8)个/视野，与未转染的阴性对照组[(103.6±4.5)个/视野]比较，差异有统计学意义(P<0.05，图3);HER2-RNAi组细胞迁移穿膜细胞的数量为[(63.6±5.1)个/视野]，与阴性对照组[(193.5±6.2)个/视野]比较，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验显示，与阴性对照组SGC-7901细胞比较，HER2-RNAi组细胞的迁移能力明显下降，见图4。

图3 沉默HER2基因对细胞侵袭能力的影响(×100)

图4 HER2-RNAi组和阴性对照组细胞划痕实验结果表现(×100)

3 讨 论

侵袭转移是进展期胃癌预后差的最主要原因，也是进展期胃癌治疗难以突破瓶颈的关键因素。故研究胃癌侵袭转移相关因素及其机制并找到抑制这些因素的策略对胃癌的治疗具有十分重要的意义。胃癌的侵袭转移机制尚不清楚，许多肿瘤的侵袭转移都和癌基因或受体基因过度表达有关，其中，HER2基因已被证实是多种肿瘤发生侵袭转移的密切相关因子，它在细胞信号转导中发挥重要作用，是细胞分化、增殖、黏附、移动的重要调节因子。Boku[6]研究证实，HER2在胃癌组织中高表达，并与胃癌的转移及预后密切相关。故本研究以HER2基因为研究对象，探讨RNAi基因沉默技术对胃癌侵袭转移能力的影响。

RNA干扰是近年来被证实在体内外沉默基因均十分有效的技术手段，具有高效性、低毒性和特异性，目前已广泛应用于许多人类基因相关疾病的诊治与研究，尤其是在恶性肿瘤、感染性疾病上取得了重大进展[7]。由于RNAi技术能够选择性抑制胃癌相关基因的表达，因此它成为胃癌治疗非常有前景的可选方法[8]。本实验中，作者采用RNAi下调胃癌SGC-7901细胞中HER2的表达，并采用实时定量PCR和Western blot方法在mRNA及蛋白表达水平上进行验证。结果证实，RNA干扰片段能有效沉默HER2基因，与阴性对照组和空白对照组比较均有显著差异。

侵袭与转移能力是癌细胞区别于正常细胞的最基本的特征。Transwell小室实验和细胞划痕实验已被国内外众多学者运用于肿瘤细胞侵袭和迁移的研究[9]，本研究亦采用Transwell小室实验和细胞划痕实验来检测RNA干扰HER2基因的表达对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果显示，侵袭和迁移实验中，与未转染阴性对照组比较，HER2-RNAi组穿膜进入下室的细胞数量均明显减少，提示下调HER2基因的表达可以使胃癌SGC-7901细胞的运动能力明显降低；细胞划痕实验结果显示，与未转染的对照组比较，HER2-RNAi组细胞的迁移能力明显下降。本研究结果表明，RNAi基因沉默能够降低胃癌的侵袭与转移能力，这与李增军等[10]利用RNAi沉默高迁移蛋白B1基因可抑制胃癌的侵袭转移的研究结果是一致的。此外，RNAi在抑制胃癌细胞的生长、促进细胞凋亡[11]，抑制胃癌血管、淋巴管的生成[12-13]，提高放疗敏感性[14]，以及逆转胃癌化疗多药耐药性[15]等方面的研究已取得了初步的成功，这为RNAi基因沉默技术在胃癌治疗上的应用奠定了良好的基础。

综上所述，RNAi沉默HER2基因可以有效抑制胃癌SGC-7901细胞的侵袭与转移，提示RNAi基因沉默技术能够产生抗侵袭转移效应，有望成为进展期胃癌治疗的新方法。

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The influence of RNAi on invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901*

PeiBo1，CunYingli2△，YaoQian3，ZhangKailian1，QinXiangnan1，DaiYouguo2，ZhaYong2

(1.GraduateSchoolofKunmingMedicalUniversity,Kunming，Yunnan650500,China；2.DepartmentofAbdominalSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650118,China；3.YunnanTumorInstitute,TumorHospitalofYunnanProvince，Kunming，Yunnan650118,China)

Objective To investigate the effect of RNA interference(RNAi) on gastric cancer cell line SGC-7901 invasion and migration by inhibiting HER2 expression.MethodsThe RNAi segments targeting HER2 were designed and transfected into cell lines with high level of HER2(HER2-RNAi group),SGC-7901 cells transfected with nagetive control series(the nagetive control group) and vacant SGC-7901 cells(the blank control group) were used as controls．The mRNA and protein expression of HER2 were detected by real-time PCR and Western blot.The invasive and migration ability of transfected tumor cells by Transwell assay and scratch assay.ResultsThe expression of HER2 was significantly reduced after the transfection(P<0.05).In invasion test，the number of cells crossing through chambers in HER2-RNAi group[(31.5±3.8)/view] was significantly lower than that in the control group[(103.6±4.5)/view](P<0.05)；in migration test，the number of cells crossing through chambem in HER2-RNAi group[(63.6±5.1)/view] was significantly lower than that in the control group[(193.5±6.2)/view](P<0.05).ConclusionHER2 silencing by RNAi suppresses the capacities of invasion and migration of human gastric cancer SGC-7901 cells,suggesting that RNAi gene silencing technique might be a new method in the treatment of advance gastric cancer．

gastric neoplasms;RNA interference;neoplasm metastasis;HER-2 gene

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.005

云南省自然科学应用基础研究基金资助项目(2010CD179、2012FB065、2014FZ034)。

：裴波(1987-)，医师，硕士，主要从事胃肠道肿瘤的基础与临床研究。△

，Tel：(0871)8185656；E-mail：kunmingcunyingli@163.com。

R735.2

A

1671-8348(2015)35-4910-03

2015-05-14

2015-07-04)