高效液相色谱法同时测定葡萄酒中5种酸性红色素

王艳丽+姜涛+宿书芳+于文江+薛霞

摘要：通过对提取溶剂、流动相条件、最大吸收波长及色谱条件的优化，建立了一种同时测定葡萄酒中坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、荧光桃红5种酸性红色素的高效液相色谱分析方法。样品经甲醇提取后，采用Symmetry C18柱进行分离 ，以甲醇-20 mmol/L醋酸铵为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果表明，各组分在0.5～50.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.1～1.0 mg/kg；在1、10、50 mg/kg三个加标水平下的平均回收率为85%～106%，相对标准偏差（RSD） 为1.5%～5.8%。

关键词：葡萄酒；酸性红色素；高效液相色谱

中图分类号：O657.7+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0117-04

葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿制而成的一类酒精饮品。通常分红葡萄酒和白葡萄酒两种。因蕴含多种氨基酸、矿物质、维生素等对人体有益成分，其营养价值得到了广泛认可。近年来，有关葡萄酒制假售假现象屡有报道，为了增强红葡萄酒的色泽同时降低生产成本，有不法企业向葡萄酒中添加人工合成色素，从而达到以假乱真的目的。长期饮用此类假酒，会对人的肝脏、肾脏等产生危害。因此对葡萄酒中可能添加的外来色素进行检测具有重要意义。

坚牢红（又名酸性红13）、偶氮玉红（又名酸性红）、孟加拉红（又名酸性红94）、奇通红S（又名酸性红52）和荧光桃红（又名酸性红92）均属于偶氮染料。GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中明确规定偶氮玉红不得在葡萄酒中添加[1]，其它四种色素在我国和欧盟等国家也均不允许在食品中使用。

目前食品中合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法[2～8]、液质联用法[9]、电动毛细管色谱法[10]和极谱法[11]。但同时测定葡萄酒中坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、和荧光桃红等5种酸性红色素的方法尚不多见。为有效监控酸性工业染料在食品中的滥用，本实验建立了高效液相色谱法同时快速测定葡萄酒中5种酸性红色素的检测方法。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MS3基本型旋涡混合仪，德国IKA；KQ5200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

甲醇，色谱纯；醋酸铵，分析纯；坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、荧光桃红，Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2标准溶液的制备

将5种色素配制成质量浓度为50 mg/L的混合标准储备液，置于4℃冰箱中保存。将混合标准储备液用水依次稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg/L的标准系列溶液。

1.3高效液相色谱条件

色谱柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；采集波长：200～630 nm；进样量：10 μL。

流动相：A为甲醇，B为20 mmol/L醋酸铵溶液。梯度洗脱程序见表1。

1.4样品处理

称取葡萄酒样品5.00 g于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

2结果与分析

2.1提取剂的选择

分别用纯水、乙醇-氨水[12]和甲醇对葡萄酒中的色素进行提取，结果发现，以纯水为提取剂，奇通红S和荧光桃红在样品中的加标回收率仅为26%～57%，可能是由于葡萄酒显酸性，而荧光桃红在酸性环境下易产生沉淀，导致回收率偏低；用乙醇-氨水溶液做提取剂，虽然回收率明显提高，但需去除氨水，步骤繁琐；用甲醇做提取剂时，样品中的色素提取完全，5种色素均能够得到理想的加标回收率（见表2）。

2.2检测波长的选择

各组分经色谱分离后，由二极管阵列检测器扫描检测，取得各组分最大吸收光谱（见图1），各组分的最大吸收波长分别为：坚牢红，514 nm；偶氮玉红，519 nm；孟加拉红，562 nm；奇通红S，557 nm；荧光桃红，547 nm。由于醋酸铵在550 nm附近基本没有吸收干扰，所以本实验将检测波长确定为550 nm。在优化的色谱条件下，各组分得到了有效分离，且避免了实际样品中杂质组分的干扰（见图2）。

2.3方法的线性范围与检出限

对配制的系列混合标准工作溶液进行测试，以峰面积Y对相应的质量浓度X进行线性回归。

各色素的线性回归方程、相关系数及方法检出限见表3，表明5种色素在0.5～50.0 mg/L范围内线性良好，相关系数均大于0.999。以3倍噪音计算方法检出限，结果为0.1～1.0 mg/kg。

2.4回收率与精密度

在不含该5种色素的葡萄酒中，分别添加各色素含量为1、10、50 mg/kg三个浓度水平的标样，每个水平平行测定6次，其回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。5种目标化合物的平均添加回收率为85%～106%，RSD均小于6.0%。

3结论

本研究在实验基础上确定了高效液相色谱法检测葡萄酒中5种酸性红色素的样品提取剂及检测波长。采用甲醇作为提取剂，提取后直接上机，在550 nm波长下进行检测，可以得到清晰的谱图，5种色素在0.5～50.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数均高于0.999，检测限0.1～1.0 mg/kg，加标回收率85%～106%，RSD均低于6.0%。本方法具有前处理简单、快速、结果准确可靠等优点，可用于葡萄酒中5种酸性红色素的同时检测。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB 2760-2011食品添加剂使用卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2011.

[2]李小平，赵永刚，陈晓红，等.固相萃取-反相高效液相色谱法同时测定葡萄酒中7种合成色素[J].中国卫生检验杂志，2013，23（12）：2566-2569.

[3]宁尚勇，高洁，许志强，等. 反相液相色谱法同时检测虾仁中合成色素的研究[J].分析试验室，2008，27（4）：72-75.

[4]霍艳敏，王骏，张卉，等. 高效液相色谱法同时测定冰淇淋中的10种合成色素[J].分析测试学报，2011，30（6）：670-673.

[5]李小燕，李梅，陈其锋，等.固相萃取-高效液相色谱检测葡萄酒中罗丹明B[J] .食品科学，2011，32（8）：238-243.

[6]陈文军. 高效液相色谱法测定食品中的合成色素酸性红26[J] .光谱实验室，2012，29（5）：2848-2851.

[7]肖海龙，屠海云，王红青，等. 反相高效液相色谱法快速测定食品中18种水溶性合成着色剂[J].中国卫生检验杂志，2011，21（2）：264-266.

[8]李玮，芮昶，屠海云，等. 高效液相色谱法测定化妆品中的7种色素[J].分析试验室，2011，30（12）：85-89.

[9]林珍珍，张水峰，曹慧，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品中非法添加的14种酸性染料[J].中国食品学报，2013，3（5）：167-172.

[10]龙巍然，王兴益，史振雨，等. 胶束电动毛细管色谱同时测定食品中13种人工合成色素[J] .分析测试学报，2012，31（9）：1100-1104.

[11]陈文，王正猛，吴晓蓉，等. 单扫描极谱法连续测定食品中非食用色素酸性金黄和酸性大红[J] .食品科学，2005，26（6）：210-212.

[12]吴国华，邵兵，赵婕，等. 饼干中酸性红测定方法研究[J] .中国卫生检验杂志，2004，14（3）：347.endprint

摘要：通过对提取溶剂、流动相条件、最大吸收波长及色谱条件的优化，建立了一种同时测定葡萄酒中坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、荧光桃红5种酸性红色素的高效液相色谱分析方法。样品经甲醇提取后，采用Symmetry C18柱进行分离 ，以甲醇-20 mmol/L醋酸铵为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果表明，各组分在0.5～50.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.1～1.0 mg/kg；在1、10、50 mg/kg三个加标水平下的平均回收率为85%～106%，相对标准偏差（RSD） 为1.5%～5.8%。

关键词：葡萄酒；酸性红色素；高效液相色谱

中图分类号：O657.7+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0117-04

葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿制而成的一类酒精饮品。通常分红葡萄酒和白葡萄酒两种。因蕴含多种氨基酸、矿物质、维生素等对人体有益成分，其营养价值得到了广泛认可。近年来，有关葡萄酒制假售假现象屡有报道，为了增强红葡萄酒的色泽同时降低生产成本，有不法企业向葡萄酒中添加人工合成色素，从而达到以假乱真的目的。长期饮用此类假酒，会对人的肝脏、肾脏等产生危害。因此对葡萄酒中可能添加的外来色素进行检测具有重要意义。

坚牢红（又名酸性红13）、偶氮玉红（又名酸性红）、孟加拉红（又名酸性红94）、奇通红S（又名酸性红52）和荧光桃红（又名酸性红92）均属于偶氮染料。GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中明确规定偶氮玉红不得在葡萄酒中添加[1]，其它四种色素在我国和欧盟等国家也均不允许在食品中使用。

目前食品中合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法[2～8]、液质联用法[9]、电动毛细管色谱法[10]和极谱法[11]。但同时测定葡萄酒中坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、和荧光桃红等5种酸性红色素的方法尚不多见。为有效监控酸性工业染料在食品中的滥用，本实验建立了高效液相色谱法同时快速测定葡萄酒中5种酸性红色素的检测方法。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MS3基本型旋涡混合仪，德国IKA；KQ5200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

甲醇，色谱纯；醋酸铵，分析纯；坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、荧光桃红，Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2标准溶液的制备

将5种色素配制成质量浓度为50 mg/L的混合标准储备液，置于4℃冰箱中保存。将混合标准储备液用水依次稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg/L的标准系列溶液。

1.3高效液相色谱条件

色谱柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；采集波长：200～630 nm；进样量：10 μL。

流动相：A为甲醇，B为20 mmol/L醋酸铵溶液。梯度洗脱程序见表1。

1.4样品处理

称取葡萄酒样品5.00 g于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

2结果与分析

2.1提取剂的选择

分别用纯水、乙醇-氨水[12]和甲醇对葡萄酒中的色素进行提取，结果发现，以纯水为提取剂，奇通红S和荧光桃红在样品中的加标回收率仅为26%～57%，可能是由于葡萄酒显酸性，而荧光桃红在酸性环境下易产生沉淀，导致回收率偏低；用乙醇-氨水溶液做提取剂，虽然回收率明显提高，但需去除氨水，步骤繁琐；用甲醇做提取剂时，样品中的色素提取完全，5种色素均能够得到理想的加标回收率（见表2）。

2.2检测波长的选择

各组分经色谱分离后，由二极管阵列检测器扫描检测，取得各组分最大吸收光谱（见图1），各组分的最大吸收波长分别为：坚牢红，514 nm；偶氮玉红，519 nm；孟加拉红，562 nm；奇通红S，557 nm；荧光桃红，547 nm。由于醋酸铵在550 nm附近基本没有吸收干扰，所以本实验将检测波长确定为550 nm。在优化的色谱条件下，各组分得到了有效分离，且避免了实际样品中杂质组分的干扰（见图2）。

2.3方法的线性范围与检出限

对配制的系列混合标准工作溶液进行测试，以峰面积Y对相应的质量浓度X进行线性回归。

各色素的线性回归方程、相关系数及方法检出限见表3，表明5种色素在0.5～50.0 mg/L范围内线性良好，相关系数均大于0.999。以3倍噪音计算方法检出限，结果为0.1～1.0 mg/kg。

2.4回收率与精密度

在不含该5种色素的葡萄酒中，分别添加各色素含量为1、10、50 mg/kg三个浓度水平的标样，每个水平平行测定6次，其回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。5种目标化合物的平均添加回收率为85%～106%，RSD均小于6.0%。

3结论

本研究在实验基础上确定了高效液相色谱法检测葡萄酒中5种酸性红色素的样品提取剂及检测波长。采用甲醇作为提取剂，提取后直接上机，在550 nm波长下进行检测，可以得到清晰的谱图，5种色素在0.5～50.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数均高于0.999，检测限0.1～1.0 mg/kg，加标回收率85%～106%，RSD均低于6.0%。本方法具有前处理简单、快速、结果准确可靠等优点，可用于葡萄酒中5种酸性红色素的同时检测。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB 2760-2011食品添加剂使用卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2011.

[2]李小平，赵永刚，陈晓红，等.固相萃取-反相高效液相色谱法同时测定葡萄酒中7种合成色素[J].中国卫生检验杂志，2013，23（12）：2566-2569.

[3]宁尚勇，高洁，许志强，等. 反相液相色谱法同时检测虾仁中合成色素的研究[J].分析试验室，2008，27（4）：72-75.

[4]霍艳敏，王骏，张卉，等. 高效液相色谱法同时测定冰淇淋中的10种合成色素[J].分析测试学报，2011，30（6）：670-673.

[5]李小燕，李梅，陈其锋，等.固相萃取-高效液相色谱检测葡萄酒中罗丹明B[J] .食品科学，2011，32（8）：238-243.

[6]陈文军. 高效液相色谱法测定食品中的合成色素酸性红26[J] .光谱实验室，2012，29（5）：2848-2851.

[7]肖海龙，屠海云，王红青，等. 反相高效液相色谱法快速测定食品中18种水溶性合成着色剂[J].中国卫生检验杂志，2011，21（2）：264-266.

[8]李玮，芮昶，屠海云，等. 高效液相色谱法测定化妆品中的7种色素[J].分析试验室，2011，30（12）：85-89.

[9]林珍珍，张水峰，曹慧，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品中非法添加的14种酸性染料[J].中国食品学报，2013，3（5）：167-172.

[10]龙巍然，王兴益，史振雨，等. 胶束电动毛细管色谱同时测定食品中13种人工合成色素[J] .分析测试学报，2012，31（9）：1100-1104.

[11]陈文，王正猛，吴晓蓉，等. 单扫描极谱法连续测定食品中非食用色素酸性金黄和酸性大红[J] .食品科学，2005，26（6）：210-212.

[12]吴国华，邵兵，赵婕，等. 饼干中酸性红测定方法研究[J] .中国卫生检验杂志，2004，14（3）：347.endprint

摘要：通过对提取溶剂、流动相条件、最大吸收波长及色谱条件的优化，建立了一种同时测定葡萄酒中坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、荧光桃红5种酸性红色素的高效液相色谱分析方法。样品经甲醇提取后，采用Symmetry C18柱进行分离 ，以甲醇-20 mmol/L醋酸铵为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果表明，各组分在0.5～50.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.1～1.0 mg/kg；在1、10、50 mg/kg三个加标水平下的平均回收率为85%～106%，相对标准偏差（RSD） 为1.5%～5.8%。

关键词：葡萄酒；酸性红色素；高效液相色谱

中图分类号：O657.7+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0117-04

葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿制而成的一类酒精饮品。通常分红葡萄酒和白葡萄酒两种。因蕴含多种氨基酸、矿物质、维生素等对人体有益成分，其营养价值得到了广泛认可。近年来，有关葡萄酒制假售假现象屡有报道，为了增强红葡萄酒的色泽同时降低生产成本，有不法企业向葡萄酒中添加人工合成色素，从而达到以假乱真的目的。长期饮用此类假酒，会对人的肝脏、肾脏等产生危害。因此对葡萄酒中可能添加的外来色素进行检测具有重要意义。

坚牢红（又名酸性红13）、偶氮玉红（又名酸性红）、孟加拉红（又名酸性红94）、奇通红S（又名酸性红52）和荧光桃红（又名酸性红92）均属于偶氮染料。GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中明确规定偶氮玉红不得在葡萄酒中添加[1]，其它四种色素在我国和欧盟等国家也均不允许在食品中使用。

目前食品中合成色素的检测方法主要有高效液相色谱法[2～8]、液质联用法[9]、电动毛细管色谱法[10]和极谱法[11]。但同时测定葡萄酒中坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、和荧光桃红等5种酸性红色素的方法尚不多见。为有效监控酸性工业染料在食品中的滥用，本实验建立了高效液相色谱法同时快速测定葡萄酒中5种酸性红色素的检测方法。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MS3基本型旋涡混合仪，德国IKA；KQ5200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

甲醇，色谱纯；醋酸铵，分析纯；坚牢红、偶氮玉红、孟加拉红、奇通红S、荧光桃红，Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2标准溶液的制备

将5种色素配制成质量浓度为50 mg/L的混合标准储备液，置于4℃冰箱中保存。将混合标准储备液用水依次稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg/L的标准系列溶液。

1.3高效液相色谱条件

色谱柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；采集波长：200～630 nm；进样量：10 μL。

流动相：A为甲醇，B为20 mmol/L醋酸铵溶液。梯度洗脱程序见表1。

1.4样品处理

称取葡萄酒样品5.00 g于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

2结果与分析

2.1提取剂的选择

分别用纯水、乙醇-氨水[12]和甲醇对葡萄酒中的色素进行提取，结果发现，以纯水为提取剂，奇通红S和荧光桃红在样品中的加标回收率仅为26%～57%，可能是由于葡萄酒显酸性，而荧光桃红在酸性环境下易产生沉淀，导致回收率偏低；用乙醇-氨水溶液做提取剂，虽然回收率明显提高，但需去除氨水，步骤繁琐；用甲醇做提取剂时，样品中的色素提取完全，5种色素均能够得到理想的加标回收率（见表2）。

2.2检测波长的选择

各组分经色谱分离后，由二极管阵列检测器扫描检测，取得各组分最大吸收光谱（见图1），各组分的最大吸收波长分别为：坚牢红，514 nm；偶氮玉红，519 nm；孟加拉红，562 nm；奇通红S，557 nm；荧光桃红，547 nm。由于醋酸铵在550 nm附近基本没有吸收干扰，所以本实验将检测波长确定为550 nm。在优化的色谱条件下，各组分得到了有效分离，且避免了实际样品中杂质组分的干扰（见图2）。

2.3方法的线性范围与检出限

对配制的系列混合标准工作溶液进行测试，以峰面积Y对相应的质量浓度X进行线性回归。

各色素的线性回归方程、相关系数及方法检出限见表3，表明5种色素在0.5～50.0 mg/L范围内线性良好，相关系数均大于0.999。以3倍噪音计算方法检出限，结果为0.1～1.0 mg/kg。

2.4回收率与精密度

在不含该5种色素的葡萄酒中，分别添加各色素含量为1、10、50 mg/kg三个浓度水平的标样，每个水平平行测定6次，其回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。5种目标化合物的平均添加回收率为85%～106%，RSD均小于6.0%。

3结论

本研究在实验基础上确定了高效液相色谱法检测葡萄酒中5种酸性红色素的样品提取剂及检测波长。采用甲醇作为提取剂，提取后直接上机，在550 nm波长下进行检测，可以得到清晰的谱图，5种色素在0.5～50.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数均高于0.999，检测限0.1～1.0 mg/kg，加标回收率85%～106%，RSD均低于6.0%。本方法具有前处理简单、快速、结果准确可靠等优点，可用于葡萄酒中5种酸性红色素的同时检测。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB 2760-2011食品添加剂使用卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2011.

[2]李小平，赵永刚，陈晓红，等.固相萃取-反相高效液相色谱法同时测定葡萄酒中7种合成色素[J].中国卫生检验杂志，2013，23（12）：2566-2569.

[3]宁尚勇，高洁，许志强，等. 反相液相色谱法同时检测虾仁中合成色素的研究[J].分析试验室，2008，27（4）：72-75.

[4]霍艳敏，王骏，张卉，等. 高效液相色谱法同时测定冰淇淋中的10种合成色素[J].分析测试学报，2011，30（6）：670-673.

[5]李小燕，李梅，陈其锋，等.固相萃取-高效液相色谱检测葡萄酒中罗丹明B[J] .食品科学，2011，32（8）：238-243.

[6]陈文军. 高效液相色谱法测定食品中的合成色素酸性红26[J] .光谱实验室，2012，29（5）：2848-2851.

[7]肖海龙，屠海云，王红青，等. 反相高效液相色谱法快速测定食品中18种水溶性合成着色剂[J].中国卫生检验杂志，2011，21（2）：264-266.

[8]李玮，芮昶，屠海云，等. 高效液相色谱法测定化妆品中的7种色素[J].分析试验室，2011，30（12）：85-89.

[9]林珍珍，张水峰，曹慧，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品中非法添加的14种酸性染料[J].中国食品学报，2013，3（5）：167-172.

[10]龙巍然，王兴益，史振雨，等. 胶束电动毛细管色谱同时测定食品中13种人工合成色素[J] .分析测试学报，2012，31（9）：1100-1104.

[11]陈文，王正猛，吴晓蓉，等. 单扫描极谱法连续测定食品中非食用色素酸性金黄和酸性大红[J] .食品科学，2005，26（6）：210-212.

[12]吴国华，邵兵，赵婕，等. 饼干中酸性红测定方法研究[J] .中国卫生检验杂志，2004，14（3）：347.endprint