反相-高效液相色谱法同时测定消炎颗粒中绿原酸与秦皮乙素的含量

王俊杰 ，刘 弘，张玲昂，张松亮(解放军第152 中心医院药学部，河南 平顶山 467000)

消炎颗粒是由金银花、紫花地丁、鱼腥草、射干、大青叶、半枝莲等6 味中药组成的复方制剂(批准文号:济制字(2011)B11049)，具有清肺热、解毒消炎之功效，常用于呼吸道感染等疾病［1］。多年来，消炎颗粒在解放军第152 中心医院的临床应用中显示出了确切的疗效，且无明显不良反应。为更好地有效控制制剂质量，本研究选择方中君药金银花、臣药紫花地丁中的有效成分绿原酸、秦皮乙素为质控指标，采用反相-高效液相色谱法(reversed-phase high performance liquid chromato-graphy，RP-HPLC)同时测定制剂中2 种成分的含量，现报告如下。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪、LC solution 色谱工作站、SPD-M20A 二极管阵列检测器(日本岛津公司)。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110753-200413，纯度≥98%);秦皮乙素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110741-200506，纯度≥98%);消炎颗粒(解放军第152 中心医院，规格:10 g/袋，批号:140501、140601、140701);甲醇、乙腈、磷酸均为色谱级，水为纯化水，其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Inertsil ODS-3 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(V ∶V=10 ∶90)，柱温:30 ℃;检测波长:327、353 nm;进样量:10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品10.26 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为102.6 μg/ml 的绿原酸对照品储备液。精密称取秦皮乙素对照品10.67 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为106.7 μg/ml 的秦皮乙素对照品储备液。精密量取绿原酸对照品储备液、秦皮乙素对照品储备液各2 ml，置于同一10 ml 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为20.52、21.34 μg/ml 的绿原酸、秦皮乙素混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取消炎颗粒2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50 ml，称定质量，超声处理(功率320 W，频率40 KHz)30 min;放冷，再称定质量，补足减失的质量，摇匀，滤过;用0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方比例称取缺金银花、紫花地丁的其他药材，按制备工艺制备缺金银花、紫花地丁的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.5 阴性干扰试验

取上述对照品溶液、供试品及阴性对照溶液，按上述色谱条件采用RP-HPLC 法测定，记录色谱图。结果显示，供试品与对照品在相同保留时间处有目标峰，阴性样品无干扰，见图1。

2.6 线性关系考察

精密量取绿原酸、秦皮乙素对照品储备液各1、2、4、6、8 ml，分别置于10 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，按上述色谱条件进样10 μl 测定，记录其峰面积。以对照品进样量为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，以最小二乘法进行线性回归拟合标准曲线。绿原酸回归方程为Y=686 752X+36 739(r=0.999 9)，表明绿原酸进样量在0.103 ～0.821 μg 范围内，其线性关系良好;秦皮乙素回归方程为Y=773 396X+75 261(r=0.999 8)，表明秦皮乙素进样量在0.107 ～0.854 μg 范围内，其线性关系良好。

2.7 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10 μl，按上述色谱条件重复进样5 次，记录其峰面积。结果显示，绿原酸的RSD为1.38%，秦皮乙素的RSD为1.66%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μl，按上述色谱条件分别于0、1、2、4、8、12、24 h 进样测定，每次记录其峰面积。结果显示，绿原酸的RSD为1.52%，秦皮乙素的RSD为1.77%，表明供试品溶液24 h 稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定5 次，每次10 μl，记录其峰面积。结果显示，绿原酸的平均含量为0.38 mg/g、RSD为1.52%，秦皮乙素的平均含量为0.18 mg/g、RSD为1.29%，表明本方法重复性好。

图1 HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram

2.10 加样回收率试验

取已知绿原酸、秦皮乙素含量的消炎颗粒样品1 g，精密称定，按80%、100%、120%分别精密加入绿原酸、秦皮乙素对照品适量，照“2.3”项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件进样10 μl，测定峰面积，计算绿原酸、秦皮乙素平均回收率，见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Test results of recovery rate

2.11 样品含量测定

制剂中有效成分含量的高低会影响疗效，控制指标成分含量可以保证产品质量稳定可靠，为制剂质量控制提供技术支持。取3 批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件对3 批样品进行含量测定，结果见表2。

表2 3 批样品中绿原酸、秦皮乙素含量测定结果(mg/g)Tab 2 Determination results of chlorogenic acid and esculetin in three batches samples(mg/g)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

在本研究预实验过程中曾考察以下流动相体系:甲醇-0.4%磷酸溶液梯度(V ∶V =20 ∶80)［2］、乙腈-0.1%磷酸溶液(V ∶V=12 ∶88)［3］、甲醇-冰醋酸(V ∶V =15 ∶85)［4］、乙腈-0.4%磷酸溶液(V ∶V=15 ∶85)［5］。结果显示，在乙腈-0.1%磷酸溶液(V ∶V =10 ∶90)流动相体系下，指标成分色谱峰峰形好，分离度好，柱效高，阴性无干扰，专属性强，可以为同类指标成分的测定提供参考。

3.2 指标成分的选择

选用消炎颗粒组方君臣药中的绿原酸、秦皮乙素成分为质控指标，与该制剂的功能主治相符，符合中医药配伍理论，可客观反映制剂的质量水平。

3.3 样品制备方法的选择

本研究分别选择甲醇［1］、50%甲醇［6］、75%乙醇［7-8］溶液作为溶剂超声30 min 处理样品。结果显示，在3 种溶剂中经超声后，指标成分均分离较好，考虑甲醇毒性较大，故本研究选择75%乙醇为溶剂超声30 min 后，取适量超声液定容后备用。

综上所述，本法分离度好、回收率高、阴性无干扰，且简便、灵敏、准确、重复性好，适用于该制剂的质量控制。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:205-206，317.

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