RP-HPLC法测定王氏保赤丸中大黄素的含量

宁恺佳,敬永生

(1.三门峡市食品药品检测中心,河南三门峡472000;2.河南大学药学院,河南开封475004)

RP-HPLC法测定王氏保赤丸中大黄素的含量

宁恺佳1,敬永生2*

(1.三门峡市食品药品检测中心,河南三门峡472000;2.河南大学药学院,河南开封475004)

目的建立反相高效液相色谱法测定王氏保赤丸中大黄素的含量的方法。方法采用RP-HPLC法测定,以Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱,以甲醇:0.2%磷酸(85:15)为流动相,流速:1.0 m L/ min,检测波长:280 nm。结果大黄素在0.202～1.212μg范围内线性关系良好,其线性方程为A=396 6.9m-1.252 2,r=0.999 9,平均回收率为97.5%,RSD=0.811%(n=9)。结论法测定王氏保赤丸中大黄素的含量线性关系好、精密度好、准确度高、稳定性好,可用于王氏保赤丸中大黄素的质量控制和含量测定。

王氏保赤丸;大黄素;RP-HPLC;含量测定

王氏保赤丸由大黄、黄连、南天星、川贝等八味药按处方制成[1],主要用于治疗小儿消化不良和成人胃肠功能失调所致乳滞疳积、上腹饱胀、呕吐腹泻、食欲不振、便秘、脾胃虚弱、发育不良等症,临床上得到极为广泛的应用。我们采用反相高效液相色谱法对该方主药中的大黄素进行了含量测定,通过线性关系、精密度、准确度、重复性、稳定性、回收率等一系列方法学验证,证明该方法准确、灵敏、简便,能够对其中大黄素进行较好的分离,并能对其含量准确测定,可作为王氏保赤丸中大黄素的质量控制和质量检测。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent高效液相色谱仪;UV―2600型紫外检测器(日本岛津);色谱柱Diamonsil-C18柱(250 mm ×4.6 mm,5μm);一次性进样器(大连依利特科学仪器公司);AG135型电子天平(瑞士,梅特勒―托利多);HS10260D型超声波清洗器(天津市恒奥科技发展公司);0.22μm有机微孔滤膜等。

1.2 试剂

大黄素对照品(中国药品生物制品检定所,批号: 200110);王氏保赤丸市售品为中国南通精华制药股份公司(批准文号:Z32020645);甲醇(高效液相色谱专用);磷酸(分析纯);纯净水(乐百氏公司)。

2 方法与结果

2.1 实验溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 用电子天平精密称取大黄素对照品10.10 mg,置于100 L容量瓶中,用流动相溶解并定容,摇匀即得101.0 mg/L的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取王氏保赤丸2支,研细,精密称重,置10 m L容量瓶中,加流动相适量,超声提取60 min,冷却至室温,取上清液至10 m L容量瓶中,用流动相稀释至刻度,静置,用0.22μm有机系滤膜过滤,在超声仪器中超声30 min,即得供试品溶液。

2.2 实验条件的选择[2]

色谱条件:Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),柱号:E2019601(购自大连依利特公司),流动相:甲醇-0.2%磷酸(85∶15),流速:1.0 m L/min,检测波长:280 nm,柱温:室温,进样量:20μL。在该色谱条件下,得到大黄素对照品溶液的HPLC图谱,见图1。供试品溶液的HPLC图谱,见图2。

图1 大黄素对照品溶液HPLC图谱

2.3 方法学考察[3]

2.3.1 线性关系 用一次性进样器精密吸取2.1.1项下的大黄素对照品溶液(101.0 mg/L),并通过0.22μm有机微孔滤膜过滤于已用大黄素对照品溶液润洗过的样品瓶中。自动进样器依次进样2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00μL(0.202～1.212μg),注入高效液相色谱仪,按2.2项下色谱条件进行测定,各进样量重复进样三次,分别记录色谱图和峰面积,取其三次峰面积平均值,按外标法以峰面积A对质量m进行线性回归,得回归方程为:A= 396 6.9m―1.252 2(r=0.999 9)。结果表明,大黄素在0.202～1.212μg范围内线性关系良好。

图2 大黄素供试品溶液HPLC图谱

2.3.2 精密度试验 用一次性进样器吸取线性关系项下的大黄素对照品溶液(101.0 mg/L),用0.22μm有机微孔滤膜过滤于样品瓶中。自动进样器进样,每次进样10μL,重复进样6次,分别记录其峰面积,测得大黄素峰面积的精密度RSD为0.20%,结果表明,该方法精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批王氏保赤丸(批号020645)样品,按2.3.6含量测定项下方法配制的供试品溶液6份,用0.22μm有机微孔滤膜过滤于已用供试品溶液润洗过的样品瓶中。取每份溶液20μL进样,记录色谱图和峰面积,测得大黄素峰面积的精密度RSD为1.12%,结果表明,该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 用一次性进样器吸取2.3.6含量测定项下王氏保赤丸供试品溶液,并用0.22μm有机微孔滤膜过滤于样品瓶中,分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样,每次进样量为20μL,连续考察12 h,记录色谱图和峰面积,计算RSD为0.15%。结果表明,王氏保赤丸供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.5 回收率试验 取2.3.6含量测定项下已知含量的6份王氏保赤丸供试品溶液,每份溶液中精密吸取3 m L的供试品溶液,分别置于10 m L容量瓶中,在相同浓度下的供试品溶液中,按对照品的80%、100%、120%的比例加入2.1.1项下制备的对照品溶液。在混有供试品和对照品的10 m L容量瓶中加入适量流动相,超声30 min,冷却至室温,用流动相稀释至刻度,静置,用一次性进样器吸取并用0.22μm微孔滤膜滤过,置于进样瓶中即得。按2.3.6项下所述“样品的含量测定”的方法进行测定,每次进样20μL,记录色谱图和峰面积,计算回收率,测得平均加样回收率为97.5%,RSD=0.81%(n=6),结果显示,用该法测定王氏保赤丸中大黄素含量准确度高。

2.3.6 样品的含量测定 按2.1项下供试品溶液的配制方法制备6份大黄素供试品溶液,用一次性进样器吸取供试品溶液,并用0.22μm有机微孔滤膜过滤于样品瓶中,超声30 min,按2.2项下色谱条件,每份进样3次,每次进样20μL,记录色谱图和峰面积,由峰面积根据回归方程计算大黄素的含量0.093 9 (%)。结果见表1。

表1 含量测定试验

3 讨论

3.1 流动相的选择

查阅文献[4-5]得知,用RP-HPLC方法单独测定大黄素的含量时,所采用的色谱条件中流动相大多数为甲醇―磷酸系统和乙腈―磷酸系统。其中甲醇―磷酸系统中磷酸溶液的浓度多为0.1%,实验过程中,发现色谱峰拖尾比较严重。若流动相改用甲醇-0.2%磷酸,拖尾现象得到明显改善,对称因子达到0.99。通过多次实验和调整,发现流动性配比在甲醇-0.2%磷酸(85∶15)时各峰的分离效果好、出峰时间理想,柱效得到提高。因此,选择甲醇-0.2%磷酸(85∶15)为流动相。

3.2 测定波长的选择

取2.1项下配制好的对照品溶液,用UV―2600型紫外检测器(日本岛津)检测,在200～450 nm波长范围内扫描,结果在221、280 nm波长处有最大吸收,故采用280 nm为测定波长。

3.3 提取方法的选择

此次实验采用超声提取和索氏提取两种方法。在索氏提取中,用流动相做提取剂,在索氏提取器中提取5 h,用高效液相色谱方法测定大黄素的含量,发现提取效果不好、费时费事,提取过程麻烦,该方法不理想。而超声提取回收率和含量,均比索氏提取效果好,并且超声提取简便,节省、不浪费。因此,选用超声提取法较为理想。

4 结论

本实验采用反相高效液相色谱法测定王氏保赤丸中大黄素的含量,以甲醇-0.2%磷酸(85∶15)为流动相,流速为1.0 m L/min,检测波长为280 nm,柱温为室温。线性关系考察得知,大黄素在0.202～1.212μg范围内线性关系良好,其线性方程为A= 396 6.9m―1.252 2(r=0.999 9),平均回收率为97.5%,RSD=0.811%(n=9),且精密度好、准确度高、稳定性及重复性均较好,可作为王氏保赤丸中大黄素含量测定的可靠方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010:22.

[2]宁恺佳.RP-HPLC法测定含感胶囊中对乙酸氨基酚的含量[J].河南大学学报(医学版),2015,3(2):100―102.

[3]夏玉凤,杨勤,王强.HPLC法测定王氏保赤丸中大黄素和盐酸小檗碱的含量[J].中成药,2004,26(3):198―201.

[4]周小江,刘塔斯.首乌藤中大黄素的含量测定[J].中华现代中西医杂志,2005,3(1):30―34.

[5]梁伟.护肝宁片中大黄素含量测定的研究[J].中医药信息,2010,27(4):78―81.

[责任编辑 李麦产]

Determination of the Emodin in Wangshibaochi Pills by RP-HPLC

NING Kaijia1，JING Yongsheng2*
（1.SɑnmenxiɑFoodɑnd Drug Inspection Center，Sɑnmenxiɑ472000，Chinɑ；2.PhɑrmɑcoCogicɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveTo establish a method for the determination of the emodin in Wangshibaochi Pills by RPHPLC.MethodsDiamonsil-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm），column number：E2019601.using methanol-0.2%Phosphoric acid（85：15）as mobile phase，the flow rate was 1.0 m L/min，and the detection wavelength was 280nm.ResultsThe concentration of the emodin was linearly related to its peak area in the rang of 0.202～1.212μg，the linear regression equation is A=396 6.9m-1.252 2，r=0.999 9.The average recovery was 97.5%，with RSD of 0.811%（n=9）.ConclusionThis method is linear、accurate、precise and stabile，It can be used for quality control and determination of content of Wangshibaochi pills.

wangshibaochi pills；emodin；RP-HPLC；content determination

R927.2

A

1672―7606(2015)04―0256―03

2015-08-23

宁恺佳(1982―),女,河南三门峡人,工程师,从事药品及医疗器械志良监测工作。

*通信作者:敬永生(1964―),男,河南驻马店人,副教授,从事药物分析化学教学与研究工作。