大分子拥挤条件下光诱导辣根过氧化物酶还原的光谱研究

曹洪玉，王 珍，唐 乾，郑学仿

（1．大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连116622；2．大连大学 辽宁省生物有机化学重点实验室，辽宁 大连116622；3．大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连116622）

蛋白质、核酸、多糖等大分子物质在细胞内的浓度很高，使得细胞内的环境是高度拥挤的，大分子在细胞内的浓度可高达80～400g／L［1］，能占细胞总容积的20%～30%［2］，由于排斥容积效应，任何可增加可用容积的反应都能被大分子拥挤试剂刺激发生［3－6］。在生物体内，大多数的生化反应都是在这种高度拥挤的环境中完成的，当蛋白存在于大分子拥挤环境中时，其微环境会发生改变，使得蛋白的结构及稳定性发生变化［2，7］，从而使得蛋白的功能表达在拥挤试剂和稀溶液中不同。

生命体的重要组成部分——血红素类蛋白，在生命体中承担着极其重要的功能，例如作为生物催化剂、电子传递蛋白、氧载体和生物传感器等［8］。由于血红素类蛋白含有原卟啉Ⅸ辅基，故其能够吸收特定波长的光，光照通过影响血红素功能的表达而影响蛋白功能。关于光照射血红素类蛋白的研究已有报道，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素P450、细胞色素C、细胞色素C氧化酶和辣根过氧化物酶等［9－14］，但是这些研究是在稀溶液中进行的，忽略了生物体细胞内的拥挤环境。目前关于血红素类蛋白在高度拥挤环境下光照的研究还很少。

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是以铁卟啉为辅基的血红蛋白，辣根过氧化物酶能利用过氧化氢氧化一些有机和无机化合物，它与植物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都紧密相关，而且对氧自由基具有消除作用，减少过氧化物对植物体的毒害作用。辣根过氧化物酶在生物传感器［15］、环境监测、工业应用［16］等方面也发挥了很大的作用，广泛地运用于基因学、生理学及病理学研究中［17，18］。

我们最近研究了紫外－可见光诱导细胞色素C、高铁肌红蛋白［19，20］和 HRP的还原及其机制，发现它们的光还原反应机制都是光诱导分子内电子转移。为了进一步了解光诱导血红素蛋白在细胞内环境中的还原过程，本文通过在光照体系中加入大分子拥挤试剂来模拟细胞内环境，研究了该条件下光诱导HRP的还原，利用紫外－可见吸收光谱、同步荧光光谱及圆二色谱等方法对拥挤环境中光照射HRP后其血红素中铁原子价态、蛋白构象及二级结构的变化进行了研究，确定了拥挤环境中HRP的最适光还原条件，分析了光照波长、温度、拥挤试剂浓度等对HRP光还原的影响。

1 实验部分

1．1 试剂与仪器

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）样品购自美国Sigma公司，使用时未经进一步提纯，溶解在0．05mol／L的 Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液（pH＝7．4）中，配置成浓度为5×10－4mol／L的蛋白溶液，蛋白溶液冷冻避光保存并尽快应用于实验。

Dextran70和Ficoll70购自上海生工公司，分别将大分子拥挤试剂Dextran70和Ficoll70溶解到pH 7．4的PB缓冲溶液中，使其终浓度达到50g／L、100 g／L、200g／L和400g／L，实验用水为去离子水。

实验仪器主要有 UV－Vis分光光度计（V－560，日本Jasco公司），荧光光谱仪（FP－6500，日本Jasco公司）和圆二色光谱仪（J－810，日本Jasco公司），制冷和加热循环器（F－12，德国Julabo公司），实验室pH计（PHSJ－4A，上海雷磁分析仪器厂），实验所用光源为荧光光谱仪的氙灯。

1．2 实验过程

1．2．1 样品处理

取20μL浓度为5×10－4mol／L的 HRP蛋白分别加入到1．98mL PB缓冲液和已配好的Dextran70、Ficoll70溶液中，得到浓度为5×10－6mol／L的HRP蛋白溶液，将蛋白样品置于10mm石英比色池中，密封并持续通入N2，用荧光光谱仪中的氙灯进行光照，然后进行光谱测定。

1．2．2 光谱测定

UV－Vis光谱测定：狭缝宽度2nm，扫描波长范围220～700nm，扫描速度200nm／min，响应时间为中等，累计扫描3次。

荧光光谱测定：将拥挤试剂Dextran70和Ficoll70放入10mm石英比色池中进行荧光光谱测定，测定条件为：激发波长280nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度为500nm／min，响应时间为0．5s，检测器灵敏度为中等，累计扫描3次。

同步荧光光谱测定：以Δλ＝20nm和Δλ＝60 nm测定处理后样品的同步荧光光谱。激发和发射狭缝均为5nm，扫描速度为500nm／min，响应时间为0．5s，检测器灵敏度为中等，累计扫描3次。

圆二色光谱测定：狭缝宽度1nm，扫描波长范围190～250nm，扫描速度50nm／min，响应时间1s，累计扫描3次。

2 结果与讨论

2．1 稀溶液／拥挤环境中HRP的紫外－可见与同步荧光光谱

在稀溶液中，辣根过氧化物酶在403nm处的吸光度为0．43，在拥挤试剂Dextran70与Ficoll70中，HRP在403nm处的吸光度分别为0．48和0．49，与稀溶液中的HRP蛋白在403nm处的紫外吸收强度相比，拥挤试剂中的HRP蛋白在403 nm处的紫外吸收强度要强。这是由于拥挤试剂对血红素周围的环境有一定的影响，血红素在拥挤试剂中暴露较多，使得吸光度较强。HRP的紫外－可见吸收光谱见图1。

图1 HRP的紫外－可见吸收光谱

色氨酸残基和酪氨酸残基是蛋白质荧光的主要贡献因素［21］。利用同步荧光光谱可得到酪氨酸和色氨酸残基的特征峰。当选择Δλ＝20nm时显示的是酪氨酸残基的荧光峰，当选择Δλ＝60nm时表现的则是色氨酸残基的荧光峰，并且色氨酸残基的荧光强度和位置对其周围的环境是敏感的［22］。色氨酸残基的最大发射波长红移，表明其所处环境极性增加，疏水性降低，蛋白疏水结构瓦解，肽链伸展程度有所增加；蓝移则表明疏水性增加，分子趋于折叠状态［23］。我们可以根据这些现象来判断蛋白质的构象变化［21］。

在稀溶液中，Δλ＝20nm时（图2A），HRP的酪氨酸残基的荧光峰在305nm处，Δλ＝60nm（图2B）时，HRP的色氨酸残基的荧光峰在344nm处。由于拥挤试剂自身能够吸收一定波长的光而发射出荧光（图3），所以在稀溶液中加入拥挤试剂时，使得HRP蛋白溶液的荧光强度急剧增强，酪氨酸和色氨酸残基的荧光峰被掩盖。与相同浓度的Dextran70相比，Ficoll70的荧光强度更强（图3C）。

2．2 不同溶液中HRP的光还原

图2 不同溶液中HRP的同步荧光光谱

图3 大分子拥挤试剂Dextran70和Ficoll70的同步荧光光谱（A）Δλ＝20nm；（B）Δλ＝60nm；（C）荧光光谱

图4 24℃，403nm光照射不同溶液中HRP其Soret带吸收峰面积的变化

辣根过氧化物酶在稀溶液与大分子拥挤试剂中采用403nm单色光照射前后Soret带吸收峰面积变化情况如图4。从图可以看出，403nm光照射 时，HRP在PB溶液及Dextran 7 0溶液中可以发生光还原反应，而在Ficoll70溶液中没有发生光还原反应。在PB溶液中HRP蛋白随着光照时间的增长被光还原的量增多，而在Dextran70溶液中，光照0．5h之内HRP蛋白被还原的量较多，随着光照时间的增长HRP蛋白被还原的量有所减少。辣根过氧化物酶在稀溶液与大分子拥挤试剂中，分别采用280nm单色光照射前后其Soret带吸收峰面积变化情况如图5。从图中可以看出，HRP蛋白在拥挤试剂Dextran70和Ficoll70溶液中有利于光还原反应的发生，并且相同光照时间内，在Ficoll70溶液中HRP蛋白被光还原的量更多。HRP的光还原机理为光诱导的蛋白分子内电子转移，在拥挤条件下HRP蛋白光还原反应易于发生的主要原因是：拥挤试剂Dextran70和Ficoll70自身均能发射荧光，在Dextran70和Ficoll70溶液中HRP蛋白的光还原程度不同，也体现了这两种拥挤试剂光吸收和荧光发射的差异。这种差异是由拥挤试剂结构的不同造成的，Dextran70的持续长度约为0．4nm，是一种无交联线性的、相对灵活的大分子聚合物，而Ficoll70具有高度交联的结构，是一种刚性共聚体。因此，当Dextran70与Ficoll70浓度相同时，Dextran70可以在溶液中形成准随机螺旋，从而容纳更多的间隙空间，排阻体积效应变小，吸收光能力变弱，使得其荧光发射强度较小，不利于HRP蛋白分子内电荷转移现象的发生。

2．3 光照波长对HRP光还原的影响

图5 24℃，280nm光照射不同溶液中HRP其Soret带吸收峰面积的变化

不同波长的光能量是不同的，对HRP的光还原情况不同，因此我们考察了拥挤条件下不同定波长光照射HRP溶液的光还原情况，图6A为在拥挤试剂Dextran70溶液中，分别用272、280、403和498nm波长的光照射HRP蛋白样品后，其Soret带吸收峰面积随光照时间的变化。发现272和498nm两种波长的光不能使HRP蛋白发生光还原反应。而280和403nm两种波长的光照射HRP蛋白溶液可以使其发生光还原反应。图6B为在拥挤试剂Ficoll70溶液中，分别用280、403和498nm波长的光照射HRP蛋白样品后，其Soret带吸收峰面积随光照时间的变化。发现只有280 nm波长的光照射蛋白溶液时能使HRP发生光还原反应。造成这种现象的原因是拥挤试剂Ficoll70在280nm处有紫外吸收，采用280nm波长的光照射HRP蛋白溶液，可以激发拥挤试剂Ficoll70发射荧光，从而诱导HRP发生还原。

图6 拥挤条件下不同定波长光照射HRP溶液后其Soret带吸收峰面积的变化

2．4 温度对HRP光还原的影响

温度的改变可引起HRP蛋白构象发生变化，而HRP蛋白构象的变化会影响其酶活性。为此我们考察了不同温度（4℃、24℃、44℃）对大分子拥挤环境中HRP光还原的影响。

图7 不同温度下光照HRP其Soret带吸收峰面积随时间的变化

在拥挤试剂Dextran70中（图7A），HRP蛋白溶液在4℃、24℃、44℃三种温度下采用403nm单色光照射0．5h后，其Soret带吸收峰面积减小都比较明显。在温度为24℃时，随着光照时间的增长，Soret带峰吸收峰面积趋于平缓，在温度为4℃和44℃时，随着光照时间的增长，Soret带吸收峰面积越来越小，且4℃时Soret带峰面积减少更明显，说明在Dextran70大分子拥挤环境中，403nm单色光照、4℃时最有利于HRP光还原反应的发生。在拥挤试剂Ficoll70中（图7B），HRP蛋白溶液在4℃、24℃、44℃三种温度下采用280nm单色光照射，随着光照时间的增加，其Soret带吸收峰面积逐渐减少，在24℃，Soret带吸收峰面积减少程度最明显，说明在拥挤试剂Ficoll70中，280nm单色光照、24℃时，最有利于HRP光还原反应的进行。

2．5 拥挤试剂浓度对HRP光还原的影响

图8为不同浓度大分子拥挤试剂中HRP光还原的情况。大分子拥挤试剂Dextran70浓度为100g／L时，光照后HRP蛋白在Soret带吸收峰面积减少的最多，浓度为400g／L时Soret带吸收峰面积反而增加。说明Dextran70浓度为100g／L时光照还原HRP的能力最强。可能是Dextran70在较高浓度时使得HRP蛋白的血红素暴露增多，Soret带的吸收峰面积增大，且当Dextran70浓度达到200g／L时会发生浓度荧光猝灭，其荧光发射强度降低，引起HRP光还原程度降低。在大分子拥挤试剂Ficoll70中，光照后HRP蛋白在Soret带吸收峰面积随着Ficoll70浓度的增大而逐渐减小，Ficoll70浓度为400g／L时吸收峰面积减少的最多，即浓度为400g／L时HRP的光还原能力最强。Ficoll70浓度增加其荧光发射强度则会逐渐增强，从而使HRP的光还原程度增大。

图8 光照后不同浓度大分子拥挤试剂中HRP Soret带吸收峰面积的变化

2．6 拥挤环境中光照射HRP二级结构的变化

某些反应引起的蛋白分子二级结构变化可以通过CD光谱进行检测，因此，我们选用远紫外区CD光谱对拥挤环境中光诱导HRP还原所引起的蛋白二级结构的变化进行检测，进一步了解拥挤环境中光诱导HRP蛋白的还原过程。不同光照时间HRP的远紫外CD光谱如图9。由图可知，稀溶液和拥挤试剂中的辣根过氧化物酶在208nm和222nm均表现出两个负峰，反映的是α－螺旋结构蛋白的特征谱带，随着光照时间的增加（0．5h、1h、2h、3h）HRP在稀溶液与拥挤试剂中208nm和222nm的两个负峰未发生变化，说明光照时间内蛋白未变性，光照后蛋白的二级结构未发生改变。

图9 不同溶液中HRP光照后的CD光谱CD spectra of HRP under different solutions

3 结论

本文通过光谱法，对光诱导大分子拥挤环境中辣根过氧化物酶的还原过程进行了研究，结果表明大分子拥挤试剂对光还原HRP的电子传递过程及效率有影响。当采用403nm单色光照射HRP蛋白溶液时，HRP在拥挤试剂葡聚糖70（Dextran70）中还原程度较好，而在聚蔗糖70（Ficoll70）拥挤环境下HRP不发生光还原反应；采用280nm单色光照射时，在大分子拥挤试剂葡聚糖70（Dextran70）和聚蔗糖70（Ficoll70）环境中，HRP光还原反应得到促进，且大分子Ficoll70溶液对HRP光还原反应的促进作用更加明显；光诱导HRP还原的最适温度在Dextran70和Ficoll70溶液中分别为4℃和24℃，定波长280nm光照射利于HRP还原；HRP在Dextran70溶液中的最适光还原浓度是100g／L，在Ficoll70环境中HRP还原程度随着Ficoll70浓度的增加增大；通过CD光谱可知光照射拥挤环境中HRP被还原后，其二级结构基本没有变化。

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