丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠外周血CD4+T细胞调节的作用研究*

彭 戬程 光马 军王南下

（1.湖北省武汉市东湖医院，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学附属协和医院，湖北 武汉430030）

·研究报告·

丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠外周血CD4+T细胞调节的作用研究*

彭 戬1程 光2马 军2王南下2

（1.湖北省武汉市东湖医院，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学附属协和医院，湖北 武汉430030）

目的探讨丹参酮Ⅱ A对脓毒症大鼠外周血CD4+T细胞的作用。方法采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型（CLP），给予丹参酮Ⅱ A（Tan Ⅱ A）处理，分别于治疗前及治疗后24、48、72 h各时间点取静脉血，流式细胞仪检测全血细胞中辅助性T细胞（Th1、Th2、Th17）；采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血中白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果CLP组大鼠血清TNF-α、IL-17、IL-1水平和Th17比例明显高于同期Sham组（P＜0.05），而TanⅡA各亚组血清TNF-α、IL-17、IL-1水平和Th17比例均低于CLP同期各亚组（P＜0.05）；CLP组大鼠血清IL-10水平和Th1/ Th2比值明显低于Sham组（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亚组血清IL-10水平和Th1/Th2比值高于CLP同期各亚组（P＜0.05）。结论丹参酮Ⅱ A可能通过作用于脓毒症大鼠的外周血CD4+T细胞发挥调节免疫、改善炎症反应的作用。

丹参酮Ⅱ A 脓毒症 CD4+T细胞

脓毒症是由感染因素诱发的一种全身性的炎症反应，并不是一种独立疾病，而是包括免疫系统在内的多系统共同作用的结果。促症/抗炎失衡以及免疫功能紊乱是脓毒症发生及发展的中心环节。因此早期控制、清除炎症因子是脓毒症的治疗关键［1-2］。丹参酮ⅡA（TanⅡA）是中药丹参的有效成分之一，具有抗炎、调节免疫功能的作用［3］，但其在脓毒症抗炎、调节免疫的临床应用及机理研究较少。因此，本研究观察了丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠促症/抗炎失衡以及免疫功能紊乱的保护作用，为临床应用提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 72只SPF级雄性Sprague Dawley大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），体质量260~ 320 g，动物许可证号：2008-0001。

1.2 试药与仪器 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液 （规格2 mL∶10 mg，上海第一生化药业有限公司生产，国药准字H31022558）。Elisa试剂盒测试盒购自武汉博士德生物工程有限公司。荧光标记的单抗购自Coalter公司，FACSCalibur流式细胞仪和Simul SET软件购自美国BD公司。其余试剂为国产分析纯（武汉康盛医药科技有限公司）。

1.3 分组与给药 将大鼠随机分成3组：盲肠结扎穿孔手术（CLP）、Tan Ⅱ A组和假手术组（Sham），每组24只，每组又再分为24、48、72 h 3个亚组，每组8只；Tan Ⅱ A组和CLP组行盲肠结扎穿孔手术，Sham组仅做盲肠探查术；Tan Ⅱ A组于术后腹腔注射20 mg/d的丹参酮Ⅱ A磺酸钠注射液 （Tan Ⅱ A），Sham组和CLP组分别于术后腹腔注射等量生理盐水，所有药物处理连续72 h，均提供相同环境和饮食。

1.4 模型制备 采取盲肠结扎穿孔手术（CLP）。模型大鼠术前禁食12 h，给予10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔注射进行麻醉，麻醉充分后置于仰卧位，消毒腹部皮肤后于中下腹部行3 cm纵行切口打开腹腔，寻找并充分暴露出盲肠，采用3号缝合线于距盲肠末端1cm处行环形结扎，盲肠仅结扎50%以保证肠道通畅，并据结扎处3~5 mm处采用9号针头贯穿盲肠3次，穿刺后手工挤压出部分肠内容物溢出于腹腔，并进行关腹手术。

1.5 标本采集与检测 1）IL-1、IL-10、IL-17和TNF-α测定。干预前和干预后24、48、72 h分别采集静脉血，低温高速离心处理（3000 r/min离心15 min），取上清。采用Elisa法检测血清中的IL-1、IL-10、IL-17和TNF-α炎性因子水平，所有操作均严格按照试剂盒的说明进行。2）流式细胞仪检测CD4+T细胞。采用直接免疫荧光标记全血溶血法流式细胞仪测定外周血Th1、Th2、Th17细胞。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血清TNF-α、IL-10、IL-1测定结果比较 见表1。CLP组大鼠血清TNF-α和IL-1水平明显高于同期Sham组（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亚组血清TNF-α和IL-1水平低于CLP同期各亚组 （P＜0.05）；CLP组大鼠血清IL-10水平明显低于Sham组 （P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亚组血清IL-10水平高于CLP同期各亚组（P＜0.05）。

2.2 各组血清IL-17、Th17、Th1/Th2测定结果比较见表2。CLP组大鼠血清IL-17水平和Th17比例明显高于同期Sham组（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亚组血清IL-17水平和Th17比例低于CLP同期各亚组 （P＜0.05）；CLP组大鼠血清Th1/Th2比值明显低于Sham组（P＜0.05），而Tan Ⅱ A各亚组血清Th1/Th2比值高于CLP同期各亚组（P＜0.05）。

表1 各组血清TNF-α、IL-10、IL-1测定结果比较（pg/mL，±s）

表1 各组血清TNF-α、IL-10、IL-1测定结果比较（pg/mL，±s）

与Sham组比较，*P＜0.05；与CLP组比较，△P＜0.05。下同。

组别时间 T N F -α S h a m组 2 4 h 2 9 . 7 ± 1 . 4（n = 8） 4 8 h 2 7 . 1 ± 1 . 3 7 2 h 2 8 . 3 ± 1 . 1 I L -1 I L -1 0 1 4 . 3 ± 1 . 5 2 3 1 . 9 ± 7 . 5 1 4 . 1 ± 1 . 2 2 2 9 . 1 ± 8 . 2 1 4 . 4 ± 1 . 0 2 3 4 . 9 ± 8 . 5 C L P组 2 4 h 2 6 5 . 6 ± 9 . 5*2 7 . 7 ± 4 . 2*1 4 5 . 1 ± 3 . 5*（n = 8） 4 8 h 3 6 . 7 ± 4 . 4*1 2 2 . 3 ± 3 . 8*3 5 9 . 8 ± 8 . 7*7 2 h 4 3 . 4 ± 3 . 2*1 0 1 . 5 ± 2 . 7*4 5 9 . 7 ± 8 . 4*T a nⅡ A组 2 4 h 1 8 . 8 ± 1 . 4*△1 8 5 . 4 ± 2 . 4*△2 1 6 . 6 ± 5 . 3*△（n = 8） 4 8 h 2 0 . 1 ± 1 . 1*△1 5 5 . 8 ± 3 . 2*△2 7 6 . 4 ± 5 . 1*△7 2 h 2 5 . 4 ± 1 . 3*△1 3 4 . 4 ± 3 . 9*△3 1 7 . 6 ± 5 . 2*△

表2 各组血清IL-17、Th17、Th1/Th2测定结果比较（±s）

表2 各组血清IL-17、Th17、Th1/Th2测定结果比较（±s）

组别 时间 T h 1 / T h 2 S h a m组 2 4 h 1 7 . 8 ± 2 . 5（n = 8） 4 8 h 1 7 . 5 ± 2 . 3 7 2 h 1 8 . 1 ± 3 . 1 I L -1 7（p g / m L） T h 1 7（%）7 . 5 ± 1 . 3 2 . 2 ± 0 . 2 7 . 8 ± 1 . 2 2 . 2 ± 0 . 2 7 . 4 ± 1 . 4 2 . 1 ± 0 . 1 C L P组 2 4 h 7 . 6 ± 1 . 1*7 7 . 7 ± 7 . 2*2 . 8 ± 0 . 2*（n = 8） 4 8 h 9 6 . 7 ± 8 . 5*3 . 7 ± 0 . 1*5 . 4 ± 0 . 7*7 2 h 1 1 5 . 4 ± 7 . 4*4 . 8 ± 0 . 2*2 . 1 ± 0 . 1*T a nⅡA组 2 4 h 4 2 . 3 ± 4 . 7*△2 . 5 ± 0 . 1*△1 4 . 3 ± 2 . 3*△（n = 8） 4 8 h 5 6 . 2 ± 5 . 0*△2 . 8 ± 0 . 2*△1 0 . 1 ± 1 . 5*△7 2 h 7 7 . 3 ± 7 . 7*△3 . 0 ± 0 . 3*△8 . 2 ± 1 . 0*△

3 讨 论

脓毒症是由感染因素诱发的全身炎症反应，是机体免疫、炎症系统在内的多系统共同作用的结果，已成为重症患者最主要的死亡原因之一［4］，而到目前为止，关于脓毒症的治疗还没有取得突破性的进展。经典治疗的失败使人们认识到免疫水平的调节可能成为脓毒症治疗的突破，但目前无论是指导治疗的免疫学指标还是纠正免疫紊乱的手段都还处于起步阶段［5］。丹参酮ⅡA是中药丹参的有效成分之一，研究已经发现其具有抗炎、调节免疫功能的作用，但其在脓毒症的临床应用方面报道较少［3］。

TNF-α是炎性递质网络通路中的关键因子，其增加可导致炎症递质失控性释放，IL-1能增加TNF-α的促炎作用，而IL-10是重要的免疫负调节因子和抗炎递质，能减少TNF-α的促炎作用［6］。笔者通过对炎性递质网络通路中的关键因子TNF-α、IL-1及IL-10在脓毒症时的变化进行了观察，发现CLP同期TNF-α和IL-1水平较对照组同期明显升高，IL-10水平有明显降低；给予Tan Ⅱ A处理的后，各亚组同期TNF-α和IL-1水平有明显降低，而IL-10水平有明显上升；证实了Tan Ⅱ A的抗炎作用。

CD4+T细胞是参与机体免疫反应的重要细胞之一，其亚群Th1、Th2细胞与Th17细胞分泌的各种细胞因子在机体促炎、抗炎中发挥着重要作用［7-8］。其中Th1细胞参与细胞免疫，介导细胞和局部炎症的免疫应答，而Th2细胞可刺激B细胞分泌抗体参与体液免疫，Th1/Th2的失衡可导致免疫抑制［9］；研究发现MODS过程中可出现Th1/Th2比值下降，表现为Th1细胞减少，而Th2细胞增加［10］；本研究发现脓毒症可导致Th1/Th2比值下降，提示机体免疫功能紊乱，而给予Tan Ⅱ A处理后其血清Th1/Th2比值高于脓毒症组同期各亚组，说明Tan Ⅱ A对脓毒症时Th1/Th2的失衡有改善作用，提示其能改善脓毒症时的机体免疫功能紊乱；Th17细胞可通过分泌IL-17诱导多种促炎性细胞因子和趋化因子，参与机体炎性反应［11-12］，发挥重要免疫调节作用，是一种重要的促炎性细胞；本研究中CLP组大鼠血清IL-17水平和Th17比例明显高于同期Sham组，而给予Tan Ⅱ A处理的各亚组中，其血清IL-17水平和Th17比例较CLP同期各亚组有显著下降，提示丹参酮Ⅱ A可通过降低脓毒症Th17细胞数量，减少血清IL-17含量来缓解其介导的促炎反应。

综上所述，随着人们对脓毒症病理生理改变和致病机制不断深入地认识，免疫功能的调理在脓毒症治疗中的重要性已经得到重视，本研究证实丹参酮Ⅱ A能通过调节Th1、Th2以及Th17细胞和IL-17抑制脓毒症大鼠炎症的发展。

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Effect of Tanshinone Ⅱ A on Peripheral Blood CD4+T Cells in Rats with Sepsis

PENG Jian，CHENG Guang，MA Jun，et al.Wuhan Donghu Hospital in Hubei Province，Hubei，Wuhan 430074，China

Objective:To explore the effect of Tanshinone Ⅱ A on the peripheral blood CD4+T cells in rats with sepsis.Methods:The sepsis rat model was established by cecal ligation and puncture operation（CLP），and the Tanshinone Ⅱ A（Tan Ⅱ A）was given for consecutive hours.the level of Th1、Th2 and Th17 were assessed by FACS flow cytometer，Enzyme linked immunoadsordent assay（ELISA）was used to determine the levels of serum interleukin-1（IL-1）、interleukin-10（IL-10）、interleukin-17（IL-17）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）were measured before and at 24，48，72 h after the treatment with Tan Ⅱ A.Results:The level of serum TNF-α、IL-17、IL-1 and Th17 ratios in each subgroup of CLP were significantly higher than that of the same period in each subgroup of Sham（P＜0.05）；and serum TNF-α，IL-17，IL-1 levels and Th17 ratio in each subgroup of Tan Ⅱ A were lower than that of the same period in each subgroup of CLP，the difference was statistically significant（P＜0.05）；The serum IL-10 level and the ratio of Th1/Th2 in each subgroup of CLP were lower than that of the same period in each subgroup of Sham（P＜0.05）；and the level of serum IL-10 and the ratio of Th1/Th2 in each subgroup of Tan Ⅱ A were higher than that of the same period in each subgroup of CLP，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion:Tanshinone Ⅱ A shows a protective effect on the immune inflammatory reaction in septic rats may be through the regulation of the peripheral blood CD4+T cells.

Tanshinone Ⅱ A；sepsis；peripheral blood CD4+T cells

R285.5

A

1004-745X（2015）06-0946-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.06.003

2015-02-26）

国家自然科学基金（30500657）；湖北省自然科学基金（2011CDB196）