红肉蜜柚汁胞枯水特性分析

(广州大学生命科学学院,广东 广州 510006)

红肉蜜柚汁胞枯水特性分析

胡位荣,刘顺枝,江月玲,林润怡,王玉林,李柏玲

(广州大学生命科学学院,广东 广州 510006)

研究红肉蜜柚果实中正常汁胞、半枯水汁胞和全枯水汁胞外观及若干生理生化指标的差异。结果表明，与正常汁胞相比，随着枯水程度的加重，红肉蜜柚果实汁胞的干物质、总糖、可滴定酸、VC、红色素、总酚含量减少，鲜质量、还原糖、蛋白质含量略有增加后再下降，汁胞的营养品质明显降低。汁胞的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性变化不同步，多酚氧化酶活性明显下降，导致丙二醛、木质素含量不断增加，汁胞呈现枯水的典型症状。

红肉蜜柚；汁胞；枯水；品质；氧化酶活性

柑橘类果实的汁胞是指着生在心皮内表皮上贮藏大量水分、糖、有机酸、色素等物质的多细胞囊状结构，是一种适应贮藏功能高度特化的组织[1]。枯水是柑橘类果实成熟后期和采后贮藏期间常见的一种生理性病害，表现为汁胞出现不规则膨大、失水变硬、干枯，颜色变淡，果肉出汁率下降，口感干燥无味[1-3]，严重影响果实的商品性。目前认为枯水主要是由柑橘果皮早衰、果皮二次生长引起营养物质从果肉向果皮转移、果肉营养过度消耗、果胶酶活力加强等引起[3-4]。Hwang等[5]从马叙葡萄柚汁胞的细胞壁结构与组成，王向阳[4]从椪柑汁胞的呼吸速率、葡萄糖转化、脱落酸含量等比较了枯水汁胞和正常汁胞之间的差异。作为我国柚类优良品种之一，琯溪蜜柚（Citrus grandis）汁胞枯水（粒化）现象严重，现有研究从解剖学、细胞学、矿质营养、内源激素、活性氧代谢、酶活性及分子生物学等角度研究了汁胞枯水发生过程及其成因，并提出了降低柚果枯水程度的栽培措施[6-9]。

作为琯溪蜜柚的天然优良芽变品种，红肉蜜柚（Citrus grandis var. Red-fleshed sweet pomelo）成熟期早，果大皮薄，无核，多汁柔软，风味酸甜适口，特别是果肉富含脂溶性色素β-胡萝卜素和番茄红素呈现红色[10]，颇受消费者青睐，售价较高，近年来在我国柚类主产区大面积推广栽种。但红肉蜜柚果实极易枯水，目前有关红肉蜜柚汁胞枯水的研究尚未见报道。本实验以红肉蜜柚为试材，分析比较半枯水和全枯水汁胞与正常汁胞的理化指标差异，以期为减轻红肉蜜柚汁胞枯水程度和贮运提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟的红肉蜜柚果实采自广东省梅县商品性生产柚园，酸柚砧高接换种树。

葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、考马斯亮蓝G-250、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、过氧化氢、邻苯二酚、愈创木酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、抗坏血酸、酚酞、牛血清白蛋白、磷酸、草酸等为国产分析纯；2,6-二氯酚靛酚钠 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

MP200A电子天平 上海天平仪器总厂；数显糖度计 日本Atago公司；DKB-450型电热恒温水浴槽上海森信实验仪器有限公司；UV-2000紫外-可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；CR21型高速冷冻离心机 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 材料处理

选取长势、结果量相似的3 株红肉蜜柚树，于2011年在果实成熟期的9月12日，采摘大小适中、无机械损伤和病虫害的30 个果实，随机分成3 组，室温条件下贮放10 d后剖取果实，根据枯水程度不同[4]，小心分离得到正常汁胞、半枯水汁胞和全枯水汁胞，取样观察、测定生理生化指标。

1.3.2 指标测定

用电子天平称量单个汁胞的质量；分别取10 g不同枯水程度汁胞于称量瓶中，烘干至恒质量，计算汁胞的干物质含量。

总糖含量和还原糖含量:分别称取枯水程度不同的汁胞3 g，以葡萄糖为标准，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定；可滴定酸含量:采用0.025 mol/L NaOH溶液中和滴定法测定；VC含量:采用2,6-二氯酚靛酚法测定；可溶性蛋白质含量:以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝G-250法测定；总酚含量:以没食子酸作标准曲线，以1% HCl-甲醇（V/V）溶液为提取剂，分别在325 nm和280 nm波长处测定提取液吸光度，并计算；丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量:采用硫代巴比妥酸法测定[11]；红色素含量:称取汁胞5 g，以石油醚为提取剂，以472 nm波长处的吸光度表示红色素（主要是番茄红素和胡萝卜素）含量[12]；木质素含量:称取汁胞15 g，按照鞠志国等[13]的方法测定。

分别称取汁胞5 g，液氮速冻后，加入预冷的4.0 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），0.2 g石英砂，冰浴研磨，4 ℃条件下16 000 r/min离心20 min，取上清液用于酶活性的测定。其中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法，以抑制NBT光化还原50%为1 个酶活力单位（U）；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚法，以OD470nm每分钟增加0.1为1 个酶活力单位（U）；过氧化氢酶（catalase,CAT）活性采用紫外分光光度法，以OD240nm每分钟减少0.01为1 个酶活力单位（U）；多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）活性采用邻苯二酚法，以OD410nm每分钟增加0.1为1 个酶活力单位（U）[11]。

1.4 数据处理

实验均重复3 次，数据用Excel进行统计，并应用SAS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 红肉蜜柚汁胞枯水的症状

图1 红肉蜜柚汁胞枯水症状Fig.1 Appearance of juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

成熟的红肉蜜柚果实一般自囊瓣近蒂端的汁胞先发生枯水，汁胞异常膨大、变硬、木质化，后逐渐向果心发展；以囊瓣开裂处的汁胞枯水最为严重；长形汁胞枯水症状明显从顶部逐渐向基部发展（图1）,这与琯溪蜜柚的结果相似[6-7]。红肉蜜柚正常汁胞显得饱满、多汁，呈均匀的红色，汁胞与汁胞之间结合紧密，难以分离；处于半枯水状态的汁胞相对较松散，呈浅红色，汁胞一端显现黄白色；全枯水的汁胞则极易分离，汁胞壁明显增厚，变硬、变空、少汁，颜色暗淡。可见，在红肉蜜柚果实枯水过程中，汁胞的形态结构发生了显著的变化。

2.2 红肉蜜柚枯水汁胞的鲜质量

与大多数研究[4,6]以整个果实的质量或质量损失率进行比较不同，实验以单个汁胞的质量进行比较。从图2可看出，半枯水汁胞的鲜质量高于正常汁胞和全枯水汁胞，其中半枯水汁胞鲜质量较正常汁胞增加了3.8%，全枯水汁胞的鲜质量则较正常汁胞降低3.6%，差异均不显著（P＞0.05）。可能是在枯水初期，果实代谢加强[2,4]，汁胞从其他部位获得或者代谢产生的水分、产物增多，导致半枯水汁胞鲜质量增加；但随着枯水加剧，营养消耗过多，导致全枯水时汁胞鲜质量降低。

图2 红肉蜜柚汁胞枯水过程中的鲜质量变化Fig.2 Fresh weight of juice sac of red-fleshed sweet pomelo during granulation

2.3 红肉蜜柚枯水汁胞的干物质含量

图3 红肉蜜柚汁胞枯水过程中的干物质含量变化Fig.3 Dry weight of juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

随着枯水程度加重，红肉蜜柚汁胞的干物质含量不断降低（图3），半枯水汁胞的干物质含量比正常汁胞的减少5.1%，全枯水汁胞的干物质含量较半枯水汁胞继续下降5.8%，差异均显著（P＜0.05）。这可能与枯水过程中旺盛的呼吸代谢导致汁胞中的大量可溶性营养消耗有关[4]。

将正常汁胞与全枯水汁胞分别置于蒸馏水中，正常汁胞因富含营养物质、色素等，比重大，在蒸馏水中很快下沉；全枯水汁胞由于干物质含量少，漂浮在蒸馏水上（图4）。

图4 红肉蜜柚枯水汁胞在蒸馏水中的浮力Fig.4 Buoyancy of granulated juice sacs of red-fleshed sweet pomelo

2.4 红肉蜜柚枯水汁胞的糖含量

近来研究[14]表明糖分不仅作为代谢基质参与呼吸作用，为其他生命活动提供能量和碳源，而且还可以作为信号分子调控相关酶和基因表达来参与果蔬成熟衰老和生理病害。从图5可以看出，随着枯水程度加重，红肉蜜柚汁胞中的总糖含量不断下降，全枯水汁胞较正常汁胞下降了15.7 mg/g。但半枯水汁胞中的还原糖含量较正常汁胞的高5.0 mg/g，全枯水汁胞的还原糖则明显低于半枯水汁胞，降幅达到37.6%；正常、半枯水、全枯水的汁胞中还原糖含量分别占总糖量的53.7%、63.5%和47.0%。可见，红肉蜜柚汁胞在枯水发生过程中，蔗糖转化为葡萄糖、果糖等还原糖，用于加强呼吸代谢以产生较多的能量，来延缓衰老或减轻生理逆境[15]。

图5 红肉蜜柚汁胞枯水过程中糖含量变化Fig.5 Content of total and reducing sugars in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

2.5 红肉蜜柚枯水汁胞的可滴定酸含量

图6 红肉蜜柚汁胞枯水过程中可滴定酸含量变化Fig.6 Titratable acid content in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

柑橘果肉中有机酸成分主要为柠檬酸，还有苹果酸，它们与糖一起形成糖酸比，是影响果实风味的重要因素之一。由图6可知，红肉蜜柚汁胞的可滴定酸含量随着枯水程度加重而不断降低，全枯水汁胞的酸含量为正常汁胞的75.9%，差异显著（P＜0.05），这与葡萄柚、琯溪蜜柚的报道[2,9]一致。可能在枯水汁胞中，有机酸本身也充当了呼吸基质，通过氧化产生能量。Wang Xianyou等[9]发现琯溪蜜柚枯水汁胞中柠檬酸和异柠檬酸含量下降，而苹果酸含量较正常汁胞高。

2.6 红肉蜜柚枯水汁胞的VC含量

柑橘类果实是人类健康所需VC的良好来源[1]。从图7可以看出，红肉蜜柚汁胞中的VC含量随着枯水程度加重而不断降低，半枯水汁胞、全枯水汁胞分别比正常汁胞低14.2%和33.9%，差异均显著（P＜0.05）。

图7 红肉蜜柚汁胞枯水过程中VC含量变化Fig.7 Vitamin C content in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

2.7 红肉蜜柚枯水汁胞的蛋白质含量

图8 红肉蜜柚汁胞枯水过程中蛋白质含量变化Fig.8 Protein content in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

由图8可知，红肉蜜柚果实中半枯水汁胞的蛋白质含量略高于正常汁胞，当汁胞全枯水时蛋白质含量较正常汁胞低7.1%。这可能是枯水发生时汁胞代谢活动加强，需合成较多的蛋白质特别是酶类[9]；枯水进一步加剧的结果导致蛋白质水解速率超过其合成速率。

2.8 红肉蜜柚枯水汁胞的红色素含量

图9 红肉蜜柚汁胞枯水过程中红色素含量变化Fig.9 red pigment content in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

红肉蜜柚的果肉因富含番茄红素和β-胡萝卜素而呈现红色。由图9可知，正常汁胞的提取液在472 nm波长处吸光度高，表明红色素含量高；半枯水时吸光度下降了一半，当汁胞全枯水时，吸光度仅为正常汁胞的32.0%，即红色素含量显著下降。这与红肉蜜柚果实枯水发生过程中汁胞色泽的变化一致（图1）。

2.9 红肉蜜柚枯水汁胞的总酚含量

柚类果实富含酚类、类黄酮等植物次生代谢产物。从图10可知，随着枯水程度加重，红肉蜜柚汁胞的总酚含量呈下降趋势，全枯水汁胞的总酚含量为正常汁胞的69.9%。

图10 红肉蜜柚汁胞枯水过程中总酚含量变化Fig.10 Total phenolic content in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

2.10 红肉蜜柚枯水汁胞的木质素含量

图11 红肉蜜柚汁胞枯水过程中木质素含量变化Fig.11 Lignin content in juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

图11表明，红肉蜜柚半枯水汁胞的木质素含量略有增加，是正常汁胞的1.3 倍；全枯水时木质素明显增多，木质素含量是正常汁胞的2.2 倍，这与枯水汁胞的口感粗糙、硬化相符。佘文琴等[8]也观察到琯溪蜜柚果肉中的木质素含量与枯水指数成显著正相关。

2.11 红肉蜜柚枯水汁胞的MDA含量

图12 红肉蜜柚汁胞枯水过程中MDA含量变化Fig.12 MDA content of juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

作为质膜过氧化作用生成的初级产物，MDA的含量可以反映细胞膜过氧化的水平和膜受伤害的程度[8,11]。从图12可知，正常汁胞的MDA含量仅0.32 nmol/g，半枯水时的汁胞MDA含量显著高于正常汁胞，达到1.4 倍，全枯水时MDA进一步积累，达到了2.3 倍。

2.12 红肉蜜柚枯水汁胞的氧化酶活性

果蔬在成熟衰老或逆境下代谢产生的大量活性氧，可被SOD催化形成H2O2，再由POD或CAT转化成H2O和O2，以维持细胞内氧自由基产生与清除的平衡，从而延缓细胞衰老[16]。

表1 红肉蜜柚汁胞枯水过程中氧化酶活性变化Table1 Oxidase activities of juice sacs of red-fleshed sweet pomelo during granulation

由表1可知，红肉蜜柚正常汁胞中的SOD活性处于较高水平，枯水发生后显著下降，全枯水时SOD活性仅为正常汁胞的29.9%。正常汁胞中的POD活性较低，汁胞发生枯水后POD活性明显升高，半枯水时较正常汁胞增加了59.6%，全枯水时POD仍然维持在较高水平，比正常汁胞高40.6%。正常汁胞的CAT较低，半枯水汁胞的CAT活性增加了89.1%，全枯水时则明显降低，仅为正常汁胞的35.7%。红肉蜜柚正常汁胞的PPO活性较高，随枯水程度加剧呈现下降趋势，半枯水汁胞的PPO活性仅为正常汁胞的54.0%，全枯水时进一步下降到43.1%。

3 讨 论

汁胞枯水是几乎所有柑橘种类果实会发生的一种生理病害[1-2,9,17]。虽然柑橘属于非呼吸跃变型果实，在贮藏过程中，呼吸强度逐渐下降，但是在枯水发生过程中，果实呼吸强度明显较高[4]。本实验中，红肉蜜柚汁胞枯水后不仅在外观上与正常汁胞之间有明显的区别，而且在汁胞营养品质指标上发生了明显变化。与正常汁胞相比，随着枯水程度的加重，汁胞的干物质、总糖、可滴定酸、VC、红色素和总酚的含量不断减少，木质素含量逐渐增加，鲜质量、还原糖、蛋白质含量略有增加后再下降。这是因为采后果实仍然进行着旺盛的呼吸作用，耗氧量增加[18]，但由于红肉蜜柚果皮厚达1.2 cm以上，富有弹性的果皮阻隔了果实内外气体的交换，造成果肉中心柱的微环境恶化，很快形成了低氧甚至无氧状态，促进了无氧呼吸，蔗糖迅速转化为葡萄糖和果糖进行旺盛的糖酵解，内部生理消耗加剧，干物质、糖类、有机酸、抗氧化物质（如VC）均明显减少，果肉中可溶性物质大量转化为不溶性物质，导致木质素增加，细胞壁加厚[2,4-5,18]，胞汁鲜质量下降，使得柚果外观看起来很正常，但果肉汁胞品质却出现了明显劣变。最终，红肉蜜柚果实中全枯水汁胞的鲜质量、干物质、总糖、可滴定酸、VC、蛋白质、红色素和总酚含量依次比正常汁胞的减少了3.6%、5.8%、20.2%、24.1%、33.9%、7.1%、68.0%、30.1%，汁胞表现出变硬、不规则膨大、干枯，颜色变淡，果肉汁液减少，口感干燥而无味。这与以琯溪蜜柚、椪柑、葡萄柚等为材料的研究结果[2,4-5,7,9]类似。

许多研究认为采后果蔬贮藏病害常常与抗氧化系统的异常相关[8,16,19]。琯溪蜜柚汁胞在成熟过程中，内源抗氧化物质含量下降，活性氧代谢失调导致H2O2积累和POD活性增强，促进了木质素的合成[8]，POD、SOD同工酶谱也发生明显的变化[20]，从而导致汁胞枯水的发生。本实验中，红肉蜜柚正常汁胞的SOD活性高，POD、CAT活性适当，MDA、木质素含量低；随着枯水的发生、发展，汁胞内源抗氧化物质如VC、酚类、类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量下降，SOD活性显著降低，POD活性维持在较高水平，CAT活性先升后降，这些酶活性变化的不同步，导致细胞内活性氧代谢失调，质膜过氧化作用加剧，MDA积累，促进木质素含量增加。此外，PPO是引起果蔬酶促褐变的主要氧化酶，红肉蜜柚半枯水和全枯水汁胞的PPO活性显著低于正常汁胞，PPO和POD在酚类物质、红色素含量下降及木质素含量增加中可能也起一定的作用[2,8]。有关红肉蜜柚汁胞枯水过程中番茄红素和β-胡萝卜素降解机理、与枯水相关基因的挖掘[21]及枯水控制措施有待于深入研究。

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Characteristics of Granulated Juice Sacs of Red-Fleshed Sweet Pomelo

HU Weirong, LIU Shunzhi, JIANG Yueling, LIN Yunyi, WANG Yulin, LI Bailing
(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

The appearance, physiological and biochemical differences among normal juice sacs, granulating juice sacs and granulated juice sacs of red-fleshed sweet pomelo (Citrus grandis) were investigated in this study. The results showed that the contents of dry matter and total sugars, titratable acid, vitamin C, red pigments and total phenolic in granulated juice sacs gradually decreased with the extent of granulation. The fresh weight and the contents of reducing sugar and protein first increased and then declined, which lowered the nutritional quality of juice sacs. The enzymes activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), and catalase (CAT) changed disorderly and polyphenoloxidase (PPO) activity significantly decreased, resulting in an increase in malondialdehyde (MDA) content and lignin synthesis, which finally caused granulation of juice sacs of red-fleshed sweet pomelo.

red-fleshed sweet pomelo; juice sac; granulation; quality; activity of oxidase

S667

A

10.7506/spkx1002-6630-201510046

2014-08-04

国家自然科学基金面上项目(30871761)；广东省科技计划项目(2010B020305014)；广东省高等院校学科建设专项(2008-342)

胡位荣(1966—),男,教授,博士,研究方向为果蔬采后生理与贮运技术。E-mail：weironghu@163.com