载锌沸石对肉鸡生产性能、抗氧化功能及其相关基因表达的影响

陈刚耀 唐志刚 乔丽红 李春梅 周岩民

（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）

载锌沸石对肉鸡生产性能、抗氧化功能及其相关基因表达的影响

陈刚耀 唐志刚 乔丽红 李春梅 周岩民

（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）

研究载锌沸石（ZnCP，锌含量为15.5 mg／g）对肉鸡生产性能、肝脏锌沉积、抗氧化功能及其相关基因表达的影响，探讨ZnCP作为抗生素替代品的可行性。300只1日龄AA（Arbor Acres）肉鸡随机分成5组，每组6个重复，每个重复10只鸡，试验期为42 d。试验日粮：1）对照组，基础日粮（含ZnSO4，锌含量为60 mg／kg）；2）基础日粮 +抗生素（40 mg／kg金霉素）；3）基础日粮 +0.1%ZnCP；4）基础日粮 +0.2%ZnCP；5）基础日粮+0.4%ZnCP。结果表明，与对照组相比，不同剂量ZnCP显著提高肉鸡前期体增重（P＜0.05），0.1%和0.2%的ZnCP显著提高21 d肝脏T-SOD和 CuZn-SOD的活性（P＜0.05），0.2%的ZnCP显著降低21 d肝脏MDA含量（P＜0.05），抗生素组和ZnCP组均能显著提高21 d肝脏T-AOC（P＜0.05）；与抗生素组相比，0.1%和0.2%的ZnCP显著降低21 d肝脏MDA含量（P＜0.05），显著提高21 d肝脏T-SOD的活性（P＜0.05），0.1%的ZnCP显著提高42 d肉鸡肝脏Nrf2 mRNA的相对表达量（P＜0.05）。与对照组和抗生素组相比，0.2%的ZnCP显著降低42 d肉鸡肝脏MDA含量（P＜0.05）。结果提示，肉鸡日粮中添加ZnCP能提高生产性能，效果等同或优于抗生素；ZnCP可能通过提高Keap1／Nrf2／ARE／抗氧化酶信号通路关键基因Nrf2的表达量来提高肉鸡的抗氧化能力；本试验条件下，日粮中ZnCP以0.1%和0.2%的添加量较好。

载锌沸石 肉鸡 生产性能 抗氧化功能 基因表达

无机抗菌剂是指利用锌、铜、银等金属及其离子的杀菌或抑菌能力制得的一类抗菌剂，具有安全、稳定、抗菌持久、无药物残留等特点，作为一种新型抗生素替代品已引起关注［1］。载锌沸石（ZnCP）属于无机抗菌剂中的一种，是将锌离子负载在沸石上制得的，具有抑制或杀灭大肠杆菌、沙门氏菌等肠道病原菌的作用［2-3］。载锌沸石可通过抑制肠道病原菌增殖来缓解病原菌对仔猪肠道造成的氧化损伤和免疫应激［4］。前期研究结果表明，在日粮中添加ZnCP能显著降低肉鸡沙门氏菌和大肠杆菌的数量，提高沙门氏菌感染肉鸡肠道的抗氧化功能和免疫能力，且其在体内的抑菌效果、缓解细菌造成的氧化应激均优于抗生素［5］。但其是否能提高正常肉鸡抗氧化能力、缓解机体因病原微生物等刺激造成的氧化应激尚需进一步研究。而Nrf2-ARE信号通路参与调控一系列抗氧化基因的表达，进而平衡机体内氧化还原体系，维持细胞正常生命活动［6］。ZnCP作为一种新型无机抗菌剂，关于其在动物生产中替代抗生素抑制肠道病原菌、保护肠道健康已有报道［4-5］，但关于其替代抗生素对肝脏抗氧化功能及Nrf2-ARE信号通路相关基因表达的研究鲜见报道。为此，本试验研究在满足AA肉鸡正常生长对锌需求的条件下，添加ZnCP对肉鸡生产性能、肝脏锌沉积、抗氧化功能及Nrf2-ARE信号通路相关基因表达的影响，进一步探讨ZnCP作为抗生素替代品是否存在其他生物学功能，以期为ZnCP的作用机制研究及合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 载锌沸石

沸石由江苏省镇江市丹徒区茅山沸石有限公司提供，粉碎过200目筛。X衍射分析表明，沸石中天然斜发沸石的含量在75%以上。参考Wang等［5］的方法，采用液相离子交换法制备ZnCP。经电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）分析，ZnCP中锌含量为15.5 mg／g。

1.2 实验动物和分组

选用300只1日龄AA肉鸡随机分成5组，每组6个重复，每个重复10只鸡，试验期为42 d。试验日粮处理如下：1）对照组，基础日粮（含ZnSO4，锌含量为 60 mg／kg）；2）基础日粮 +抗生素（40 mg／kg金霉素）；3）基础日粮 +0.1%ZnCP；4）基础日粮 +0.2%ZnCP；5）基础日粮+0.4%ZnCP。试验基础日粮见表1。

1.3 饲养管理

肉鸡饲养于同一鸡舍内，采用3层笼笼养，自由饮水，24 h光照，夜间光照强度以使肉鸡能自由采食、饮水即可。免疫程序按常规进行。定时饲喂试验饲料，每天2次，早上8：00及下午17：00各1次。试验在南京康欣禽业有限公司进行，试验期为42 d。

1.4 样品采集和制备

于21 d和42 d，从各组每个重复中各取1只体重相近的公鸡，颈椎脱臼法致死，迅速打开腹腔，在每只鸡相同部位取适量肝脏迅速置于液氮中保存，用于分析肝脏锌沉积、抗氧化指标和相关基因表达水平。

1.5 指标分析

1.5.1 生产性能

记录各重复肉鸡的耗料量，在试验第21天和第42天对肉鸡进行空腹称重。称重前停料12 h，自由饮水。计算肉鸡的体增重（BWG）、采食量（FI）和料重比（F／G）。

1.5.2 肝脏锌含量

准确称取2.0 g肝脏置于消解管中，加10 mL纯硝酸和高氯酸混合液（体积比＝4∶1），静置一段时间后采用电热消解仪消解（Labtech DigiBlock EHD36）。消解完成后定容于25 mL容量瓶，取10 mL采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定肝脏中锌含量。

1.5.3 肝脏抗氧化指标

取0.2 g左右肝脏于10 mL离心管中，加入9倍体积4℃下预冷的0.86%生理盐水，在冰水浴中匀浆30 s后，于4°C下3 000 r／min离心15 min，取上清液采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（TSOD）、铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.5.4 基因表达量测定

将42 d肉鸡肝脏样品从液氮中取出，迅速剪取约50～100 mg，加入 1 mL RNAisoTMPlus试剂（Takara，D9108A），按试剂盒说明书方法提取总RNA。用分光光度计（Nanodrop ND-1000）检测总RNA浓度及纯度；用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，将RNA溶液稀释为1.0μg／μL。

按照试剂盒说明书，用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Takara，DRR037S）对样品提取的 RNA立即进行反转录。反转录反应程序为：37℃ 15 min，85℃5 s，然后降温至4℃，将反转录产物cDNA置于-20℃保存。内参基因β-action和GAPDH，以及Nrf2和CuZn-SOD基因的引物序列及产物大小见表2，引物用Primer Premier 5软件设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。

按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（Takara，DRR081A）说明书，用实时定量 PCR仪（Bio-Rad CFX）对反转录产物cDNA进行定量PCR。反应程序为：95℃预热30 s，40个 PCR循环，每个循环中95℃变性5 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸30～40 s。使用β-action和GAPDH为双内参，用Bio-Rad CFX Manager软件中的 2—△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.6 数据处理

数据用Excel 2003初步处理后，采用SPSS16.0软件进行统计，用单因素方差分析（One-way ANOVA，Duncan）进行差异显著性检验和多重比较，结果以“平均数±标准误”表示。

表2 引物详细信息

2 结果

2.1 载锌沸石对肉鸡生产性能的影响

由表3可知，与对照组相比，日粮中添加不同剂量ZnCP显著提高1～21 d肉鸡的体增重（P＜0.05），对采食量和料重比无显著影响（P＞0.05）；对22～42 d、1～42 d肉鸡体增重、采食量和料重比均无显著影响（P＞0.05）。在肉鸡2个生长阶段内，与抗生素组相比，ZnCP改善了肉鸡的体增重、采食量和料重比，但差异不显著（P＞0.05）。

2.2 载锌沸石对肉鸡肝脏锌元素含量的影响

图1 ZnCP对肉鸡肝脏锌元素含量的影响

由图1可知，与对照组相比，日粮中添加载锌沸石可提高21 d肝脏中金属元素Zn的含量，但差异不显著（P＞0.05）。与对照组和抗生素组相比，3种不同添加量的载锌沸石有提高42 d肝脏锌元素含量的趋势（P＝0.08），其中，0.1%、0.2%和0.4%ZnCP添加组肝脏锌含量分别提高了5.4%、8.2%和8.8%。

2.3 载锌沸石对肉鸡肝脏抗氧化能力的影响

由表4可知，与对照组相比，0.2%ZnCP能显著降低21 d和42 d肝脏中MDA的含量（P＜0.05），抗生素组和不同剂量ZnCP能显著提高21 d肝脏的T-AOC（P＜0.05），0.1%和0.2%ZnCP能显著提高21 d肝脏 T-SOD、CuZn-SOD的活性（P＜0.05）。与抗生素组相比，0.1%和0.2%ZnCP显著降低21 d肝脏中MDA的含量（P＜0.05），显著提高21 d肝脏T-SOD的活性（P＜0.05），0.2%ZnCP能显著降低42 d肝脏中MDA的含量（P＜0.05）。与对照组和抗生素组相比，不同剂量ZnCP对42 d肝脏的TAOC、T-SOD和 CuZn-SOD没有显著影响（P＞0.05）。

表3 载锌沸石对肉鸡生产性能的影响

表4 载锌沸石对肉鸡肝脏抗氧化能力的影响

2.4 载锌沸石对肝脏Nrf2 mRNA、CuZn-SOD mRNA表达量的影响

由图2可知，与对照组相比，日粮中添加ZnCP对肝脏Nrf2 mRNA的表达量没有显著影响（P＞0.05），但与抗生素组相比，0.1%ZnCP能显著提高肝脏中Nrf2 mRNA的相对表达量（P＜0.05），日粮中添加ZnCP对CuZn-SOD mRNA表达量没有显著影响（P＞0.05）。

图2 ZnCP对肝脏Nrf2 mRNA、CuZn-SOD mRNA相对表达量的影响

3 讨论

3.1 载锌沸石对肉鸡生产性能的影响

无机抗菌材料已广泛用于抑制病原微生物，同时这些物质亦可以提高动物生产性能［7］。Xia等［8］试验发现，饲料中添加1.5 g／kg载铜蒙脱石能显著提高肉鸡日增重、降低料重比。罗有文［1］研究表明，日粮中添加载锌凹土能显著提高肉鸡前期的体重和平均日增重，后期生产性能均有提高趋势。本试验表明，与对照组相比，日粮中添加不同剂量的ZnCP显著提高了肉鸡1～21 d的体增重，并有降低1～42 d料重比的趋势；与抗生素组相比，其生产性能也有所改善，说明载锌沸石对肉鸡的促生长效应等同或优于抗生素。关于ZnCP提高肉鸡生产性能的机理，可能与ZnCP的抑菌作用和提高抗氧化能力有关。ZnCP能够减少沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌对肠道的危害［5，9］，提高肉鸡肠道 SOD酶活性，降低因病原菌感染造成的氧化损伤［5］。同时，ZnCP具有的缓释、离子交换作用［10］，使锌离子能够到达特定肠段持久发挥其抑菌的作用，改善肠道环境，从而提高肉鸡的生产性能。另外，ZnCP的缓释作用也提高了锌在动物体的利用率，对动物的生长也有促进作用。

3.2 载锌沸石对肉鸡肝脏锌元素沉积和抗氧化功能的影响

锌是动物体内许多种酶的组成成分或激活因子，对免疫和抗氧化能力等生理功能具有重要作用［11］。锌广泛分布于动物体内各组织中，其中肝脏、胫骨和胰腺等对日粮锌水平的变化较为敏感［12］。本试验表明，日粮中添加不同水平ZnCP对21 d肉鸡肝脏锌元素的含量影响不显著，对42 d肝脏锌含量有提高趋势，说明日粮中添加ZnCP可以增加组织细胞的锌沉积，但差异不显著，可能原因是载锌沸石添加量过低所致。本试验还需进一步测定胰腺和胫骨中锌的含量。

MDA是体内脂质过氧化的主要终产物，MDA含量可以反映机体的氧化应激状态。T-SOD和CuZn-SOD是抗氧化酶防御系统中最重要的酶之一［13］。SOD可以通过酶促反应清除机体内的超氧阴离子自由基。T-AOC能反映机体总抗氧化能力的高低。Coudray等［14］在人和大鼠上通过体外和体内试验证明了锌可以调节CuZn-SOD活力。刘泽辉［15］研究证实饲料中添加锌可以提高CuZn-SOD活力和肝脏MT含量，降低肝脏中MDA含量，增强机体抗氧化性能。有研究表明，载锌凹土可提高肝脏CAT活性，降低 MDA含量，减少肠道有害菌的数量［1］。本试验中，与对照组相比，抗生素组显著提高前期T-AOC，其他指标没有显著变化，说明抗生素对前期肉鸡的抗氧化性能有一定改善作用，但后期试验阶段作用不明显；而ZnCP与对照组和抗生素组相比，改善了肉鸡整个生长阶段的抗氧化指标，且0.1%和0.2%的ZnCP较好，说明ZnCP能提高肉鸡的抗氧化能力，且效果优于对照组和抗生素组。有研究结果表明，ZnCP提高肉鸡抗氧化性能的可能原因是ZnCP能抑制有害菌的增殖，减少其对动物机体造成的氧化应激［5］。同时，有研究指出沸石作为目标药物载体能够延长药物作用时间［16］。因此，将锌离子负载在沸石上所制得的ZnCP所具有的缓释功能可以持久维持组织细胞中锌含量的稳定，其提供的锌是SOD的金属辅基，从而维持CuZn-SOD结构稳定性［1］。ZnCP基于以上功能，可提高肉鸡肝脏抗氧化酶活性，减少自由基攻击，从而降低MDA的含量。此外，本试验中0.1%和0.2%ZnCP添加量要优于0.4%添加组，说明适量ZnCP对动物抗氧化功能有促进作用，但关于ZnCP添加水平和抗氧化之间的关系还需要进一步研究。

3.3 载锌沸石对肉鸡肝脏Nrf2 mRNA、CuZn-SOD mRNA表达水平的影响。

Keap1-Nrf2-ARE通路作为机体抗氧化通路之一，参与调控和消除氧化应激，从而避免氧化应激导致的损伤。Nrf2即核转录因子NF-E2相关因子2，在各组织细胞抗氧化应激反应中处于核心地位。Liu等［17］研究发现，给大鼠和小鼠连续注射4 d适量的ZnCl2可显著提高肝脏 MT、Nrf2的基因表达量。本试验结果显示，与抗生素组相比，日粮中添加0.1%的ZnCP显著提高了肉仔鸡肝脏Nrf2基因的表达量，与对照组相比Nrf2 mRNA表达量也有提高，说明ZnCP能诱导Nrf2-ARE信号通路关键基因Nrf2的表达，从而调节相关抗氧化酶基因的表达，提高动物抗氧化能力，这可能与ZnCP的缓释作用可维持细胞内锌离子水平有关。另外，也有研究表明Zn可以激活Keapl的感应元件［18］，调控Nrf2与Keapl的分离，从而调节靶基因的表达，诱导机体产生抗氧化酶和相关代谢酶，以此来维持细胞内氧化还原状态的平衡和降低氧化损伤。Nrf2可调控下游多种基因的表达，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶、醌氧化还原酶等［19］。本试验中，日粮中添加ZnCP没有显著提高CuZn-SOD mRNA表达水平，可能是由于Nrf2主要调控了过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶的表达，其机理有待进一步研究。

4 结论

日粮中添加ZnCP能提高肉鸡生产性能，效果等同或优于抗生素；3种添加量的ZnCP均可提高肉仔鸡肝脏的抗氧化功能，本试验中以0.1%和0.2%ZnCP添加量较好；ZnCP可提高 Keap1／Nrf2／ARE／抗氧化酶信号通路关键基因的表达量，0.1%ZnCP达到显著水平。

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Effects of Zinc-Bearing Clinoptilolite on Growth Performance，Antioxidant Function and Genes Expression of Broiler Chickens

Chen Gangyao Tang Zhigang Qiao Lihong Li Chunmei Zhou Yanmin
（College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）

The paper has conducted to evaluate the effect of zinc-bearing clinoptilolite（ZnCP，containing Zn 15.5 mg／g）addition for its replacing antibiotics on growth performance，as well as the content in liver，antioxidant function and relevant genes expression of broiler chickens.300 one-day-old Arbor Acres broiler chickens were randomly divided into 5 groups with 6 replicates of 10 chickens for a 42-d feeding trial.The dietary treatments were as follows：1）control fed a basal diet with 60 mg／kg zinc from ZnSO4；2）the basal diet plus antibiotics（ANT，40 mg chlortetracycline per kg of diet）；3）the basal diet plus0.1%ZnCP；4）the basal diet plus0.2%ZnCP；5）the basal diet plus0.4%ZnCP.The results showed that compared to control，ZnCPtreatments caused positive effects on BWG（P＜0.05）of broilers chickens within 1～21 d.The activities of T-SOD and Cu-Zn SOD in liver increased by 0.1%and 0.2%ZnCP respectively at 21 d（P＜0.05）.MDA contents in liver on 21 d were reduced by 0.2%ZnCP（P＜0.05）.ANT and ZnCP treatments increased T-AOC in liver on 21 d（P＜0.05）.Compared to ANT，0.1%and 0.2%ZnCP reduced MDA contents（P＜0.05）and increased T-SOD activity in liver on 21 d（P＜0.05）.Nrf2 mRNA level in liver raised by 0.1%ZnCPon 42 d（P＜0.05）.Compared to control and ANT，0.2%ZnCP improved MDA contents in liver on 42 d（P＜0.05）.The results indicated that addition of 0.1%or 0.2%ZnCPcould improve the growth performance of broiler chickens，and the effect was equivalent to or better than that of the antibiotics.ZnCP can improve antioxidant ability of broiler chickens by elevating the Nrf2 mRNA expression of Keap1／Nrf2／ARE／signaling pathway.

zinc-bearing clinoptilolite，broiler，growth performance，antioxidant function，gene expression

S815

A

1003-0174（2015）02-0074-06

2013-10-31

陈刚耀，男，1988年出生，硕士，动物营养与饲料科学

周岩民，男，1963年出生，教授，博士生导师，动物营养与饲料科学